Análisis molecular del mecanismo de formación de poros por parte de las actinoporinas

Resumen

Las actinoporinas constituyen una familia de proteínas tóxicas sintetizadas por anémonas marinas. Son pequeñas, básicas, normalmente sin cisteínas, y tienen una actividad citotóxica que radica en su capacidad para formar poros en las membranas biológicas. En disolución acuosa estas proteínas mantienen su forma monomérica y globular pero, cuando interaccionan con membranas lipídicas de una composición específica, se integran en la bicapa como estructuras oligoméricas que dan lugar a la formación de poros. Todas las actinoporinas estudiadas hasta ahora se pliegan en forma de un núcleo constituido por un sándwich beta flanqueado por dos hélices, una de las cuales se localiza en el extremo N-terminal. Las membranas que constituyen la diana de estas actinoporinas deben contener esfingomielina (SM), pero otras características de la bicapa, como la presencia de esteroles, la coexistencia de fases, la compactibilidad, la fluidez o la fuerza de la red de puentes de hidrógeno en la interfase, parecen ejercer también una gran influencia en la formación de los poros. Existe un consenso general acerca de los pasos que llevan a la formación del poro. Primero las actinoporinas se unirían a la membrana guiadas por su afinidad hacia SM. Seguidamente, sería necesario que se alargue la hélice N-terminal, que se insertaría en la membrana, a la vez que la proteína difundiría por la superficie de la bicapa y oligomerizaría para formar el poro funcional. Sin embargo, varios aspectos de este mecanismo, como la estequiometria de dicho poro, el orden en el que tienen lugar los eventos que conducen a la inserción de la hélice o la existencia de estructuras tipo preporo, no están aún resueltos y son objeto de intenso debate. Con el propósito de profundizar en este mecanismo, se propusieron los siguientes objetivos: (i) el estudio de la relevancia de la composición lipídica de la membrana en cada paso del mecanismo de acción de las actinoporinas; (ii) la producción de actinoporinas naturales y artificiales con el propósito de estudiar sus características estructurales y funcionales y su habilidad para interaccionar con diferentes vesículas lipídicas y/o membranas biológicas; y (iii) el estudio del mecanismo de ensamblaje de un poro funcional, así como la influencia de la composición de la membrana en su estructura y funcionalidad mediante el uso de diferentes sistemas lipídicos, incluyendo nanodiscos. Los resultados contenidos en este trabajo han permitido elaborar las siguientes conclusiones. Primero, el colesterol (Chol) y la red de puentes de hidrógeno establecida por las moléculas de SM han demostrado ser clave para entender la unión de las actinoporinas a la membrana y la consiguiente formación del poro. Por otro lado, mutaciones puntuales de residuos localizados en regiones clave de estas proteínas, que alteraron su capacidad de unión a las membranas, su libertad conformacional, su correcta oligomerización y/o la distribución electrostática de zonas bien definidas de la estructura, dieron lugar a proteínas que presentaban una menor capacidad de unión a la membrana y/o formación de un poro funcional. Estos resultados permitieron definir las condiciones concretas de composición y propiedades biofísicas de las membranas que optimizan su interacción funcional. Además, posibilitaron la definición de funciones específicas para algunos residuos concretos, y ciertas regiones proteicas, cuyo papel no se conocía previamente. En este mismo sentido, la comparación estructural y funcional de diferentes actinoporinas naturales, bien caracterizadas y producidas por distintas anémonas, facilitaron la comprensión de algunas de las relaciones estructura-función de estas toxinas. Finalmente, se demostró que los nanodiscos son una herramienta inestimable a la hora de conseguir una partícula soluble que contenga un poro biológicamente representativo, funcional, formado por actinoporinas y susceptible de ser estudiado mediante criomicroscopía electrónica.