Papel biológico del diadenosin tetrafosfato en el ojoefecto sobre la composición lacrimal e implicación en la función de barrera corneal

Resumen

El Ap4A es un dinucleótido con un amplio papel biológico en el ojo, el cual interviene en procesos de secreción lagrimal, cicatrización epitelial, regulación de la presión intraocular, y presenta además un papel neuroprotector sobre los terminales simpáticos que inervan el cuerpo ciliar. En la presente Tesis Doctoral se analizaron otras posibles funciones del Ap4A a nivel ocular, estudiando su capacidad para estimular la liberación de proteínas de acción antibacteriana tales como la lisozima y la lactoferrina, presentes en la lágrima de conejos albinos de Nueva Zelanda, mediante las técnicas de agar-agar y ELISA. Los resultados obtenidos demostraron que Ap4A produce un aumento en la concentración de dichas proteínas frente a valores basales, efecto mediado por receptores de tipo P2. Por otra parte se evaluó la acción de Ap4A sobre la función de barrera en cultivos de células de epitelio corneal humano (HCLE) mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER), obteniéndose una reducción en dichas medidas 2 h después de la aplicación de Ap4A, lo que indicó un aumento en la permeabilidad paracelular corneal. Por otra parte se investigó su efecto como modulador de la función de barrera de la córnea a través de la regulación de los niveles de expresión de proteínas constituyentes de las tight junctions (TJ), en particular de ZO-1, ocludina y claudina-7. La aplicación de Ap4A durante cinco minutos indujo una disminución en los niveles de dichas proteínas, transcurridas dos horas del tratamiento con el dinucleótido. Este efecto parece estar mediado por receptores P2Y2 y la vía de señalización de las proteínas ERK 1/2, hallazgo que se dedujo mediante ensayos de silenciamiento con RNAs de interferencia frente al receptor P2Y2 y el empleo de antagonistas específicos para esta ruta de señalización. Por otra parte se realizaron estudios de inmunofluorescencia en células HCLE y en preparaciones en plano de córneas de conejos albinos de Nueva Zelanda, los cuales revelaron una clara disminución del marcaje de la proteína ZO-1 tras la aplicación tópica de Ap4A. Además, se realizaron ensayos in vivo en dichos animales para analizar si el incremento en la permeabilidad de la barrera corneal inducido por Ap4A podría facilitar el acceso de compuestos antiglaucomatosos (como el análogo de la melatonina 5-MCA-NAT y los fármacos adrenérgicos brimonidina y timolol) en el humor acuoso de los animales. Cuando se instiló Ap4A 2 h antes de los respectivos tratamientos, fue posible detectar un incremento en los niveles de los compuestos en el humor acuoso junto a un aumento del efecto hipotensor producido, en comparación con los valores correspondientes a los tratamientos sin el dinucleótido. Por último, considerando la acción que el Ap4A ejerce en las TJ y en la formación de la barrera en el epitelio corneal, se investigó su posible implicación en los potenciales cambios subyacentes de dichas proteínas en situaciones patológicas que afectan a la función de barrera del endotelio corneal, con procesos de edematización corneal. Para ello se evaluaron los niveles de Ap4A mediante HPLC en el humor acuoso de ratones glaucomatosos DBA/2J (los cuales presentan un proceso de edematización corneal), a los 3 y 15 meses (estadios en ausencia de patología y donde la patología está avanzada, respectivamente), comparándolos con los de ratones sanos C57BL/6 en las mismas edades. Los resultados obtenidos mostraron niveles elevados de Ap4A en el ratón DBA/2J a los 15 meses frente al estadio de 3 meses y a los obtenidos en el ratón control C57BL/6. Asimismo, en el estadio donde la patología estaba avanzada se detectó una alteración en la expresión de ZO-1, así como una reducción significativa de los niveles proteicos de dicha proteína en comparación con el ratón control C57BL/6 y con respecto al estadio de 3 meses en el ratón DBA/2J. Estos resultados sugieren la posible implicación de Ap4A en el proceso de edematización observado en el ratón DBA/2J.