Identificación de reductasas de ácidos hidroxicinámicos y sus derivados en lactobacillus plantarum WCFS1

Resumen

Los ácidos fenólicos constituyen aproximadamente un tercio de los compuestos fenólicos de la dieta y están asociados con propiedades organolépticas, nutricionales y antioxidantes de los alimentos. Este grupo incluye compuestos que poseen al menos un grupo hidroxilo y un ácido carboxílico como grupo funcional. Se pueden dividir en dos grupos en función de su estructura: los ácidos hidroxicinámicos y los ácidos hidroxibenzoicos, siendo más comunes los primeros. Entre los ácidos hidroxicinámicos se encuentran los ácidos p-cumarico, caféico, ferúlico y sinápico. Lactobacillus plantarum es la especie de bacteria láctica que más frecuentemente se aísla de fermentaciones de alimentos de origen vegetal. En L. plantarum, el metabolismo de los ácidos hidroxicinámicos puede seguir dos rutas. Por un lado, pueden reducirse directamente a sus correspondientes ácidos fenilpropiónicos sustituidos mediante una reductasa; la otra ruta implica la acción secuencial de dos enzimas, en primer lugar una descarboxilasa que descarboxila el ácido a su vinil derivado y posteriormente una reductasa que lo reduce a su correspondiente etil derivado. Al comienzo de esta tesis, de todas las enzimas implicadas en este proceso, tan solo se había descrito a nivel molecular la descarboxilasa Lp_3665, permaneciendo desconocidas las reductasas implicadas en ambas rutas. El estudio transcriptómico global de la respuesta de L. plantarum WCFS1 a la presencia del ácido p-cumárico reveló que tres genes que codificaban posibles reductasas mostraban una inducción de su expresión (lp_1424, lp_1425 y lp_3125). La interrupción de estos genes en L. plantarum WCFS1, mediante un proceso de inserción duplicación por recombinación homóloga, demostró que los mutantes en los que se habían interrumpido los genes lp_1424 y lp_1425 no fueron capaces de reducir los ácidos hidroxicinámicos mientras que el mutante del gen lp_3125 no redujo los vinil a etil fenoles. Un análisis de expresión génica confirmó que para la reducción de los ácidos hidroxicinámicos es necesaria la presencia de una proteína Lp_1425 funcional. Extractos de Escherichia coli en los que se hiperexpresó el gen lp_1425 redujeron los ácidos hidroxicinámicos ensayados. Sin embargo, las reacciones in vitro usando la proteína recombinante hiperproducida y purificada no fueron capaces de reducirlos. Un análisis electroforético de esta proteína reveló que se proteoliza y sólo el dominio carboxilo-terminal de unión a FAD está presente después de su purificación y diálisis. Dado que los genes lp_1424 y lp_1425 se expresan juntos en L. plantarum, ambos se expresaron simultáneamente en E. coli. Los resultados indicaron que ambas proteínas se purificaban juntas y que la presencia de Lp_1424 evita parcialmente la proteólisis de Lp_1425. En relación a la especificidad de sustrato, se observó que la proteína Lp_1425 redujo todos los ácidos hidroxicinámicos analizados. Los análisis por HPLC y la detección del gen mediante PCR confirmaron que, de todas las bacterias lácticas ensayadas, solamente aquellas que pertenecían al grupo de L. plantarum así como Enterococcus casseliflavus y Enterococcus gallinarum poseían la capacidad de reducir ácidos hidroxicinámicos. Puesto que la inactivación del gen lp_3125 impide la reducción de los vinil fenoles a sus correspondientes etil fenoles en L. plantarum, este gen se hiperexpresó en E. coli. Extractos de E. coli con el gen lp_3125 hiperexpresado redujeron los vinil fenoles ensayados. Por el contrario, en las reacciones in vitro utilizando la proteína recombinante hiperproducida y purificada no se observó reducción. Los análisis por HPLC y PCR revelaron que la capacidad para reducir los vinil fenoles es poco frecuente entre las bacterias lácticas, estando presente en bacterias del grupo de L. plantarum.