Identificación, clonaje, purificación y caracterización inmunológica de alérgenos únicos y de reactividad cruzada del mosquito Aedes aegypti

Resumen

Aedes aegypti es una especie de mosquito que se ha expandido en todos los continentes y se ha especializado en alimentarse de humanos. Se ha propuesto A. aegypti puede inducir diferentes tipos de respuestas alérgicas. En esta tesis estudiamos la composición alergénica de A. aegypti y evaluamos su potencial alergénico y reactividad cruzada. Usamos dos enfoques para identificar alérgenos. El estudio del Alergenoma de A. aegypti, mediante el análisis del espectro de proteínas separadas por electroforesis bidimensional, ensayos de unión a IgE y caracterización mediante espectrometría de masas. Se identificaron diez proteínas. Algunas presentaron variantes, o isoformas. La mezcla de tres de estos alérgenos fue suficiente para identificar casi todos los individuos sensibilizados. En un segundo enfoque, la tropomiosina natural de A. aegypti se purificó mediante cromatografía de exclusión y de intercambio iónico. Se encontró que en A. aegypti, la tropomiosina consiste en una mezcla de al menos 4 versiones (isoformas y variantes). Dos de estas versiones (Códigos UNIPROT: Q17H75 y Q17H80) se encontraron en mayores cantidades relativas. El análisis de la secuencia de aminoácidos y experimentos de inhibición indicaron que Q17H75 es potencialmente más alergénica y de mayor reactividad cruzada que Q17H80. Como resultado de estos estudios, seis nuevos alérgenos de A. aegypti fueron registrados en la base de datos de alérgenos: Aed a 5 (proteína sarcoplásmica de unión calcio), Aed a 6 (Porina 3), Aed a 7 (proteína de función no definida), Aed a 8 (Heat shock cognate70), dos variantes de tropomiosina (Aed a 10.0101 y Aed a 10.0201) y Aed a 11 (proteasa de aspártico lisosómica). Las versiones inmunológicamente activas de Aed a 10.0101, Aed a 10.0201 y Aed a 8 se expresaron en E. coli y se purificaron por afinidad. Los recombinantes mostraron capacidad de unión a anticuerpos, activación de basófilos e inmunogenicidad. rAed a 10.0101 y rAed a 10.0201 presentaron espectros de dicroísmo circular de proteínas alfa helicoidales. Ratones inmunizados con rAed a 8 produjeron niveles bajos de IgE y altos niveles de IgG, especialmente IgG2a, sugiriendo que podría tener propiedades inmuno reguladoras. Nuestros estudios demostraron que A. aegypti tiene alta reactividad cruzada con el camarón Litopenaeus vannamei, seguido por los ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus, Blomia tropicalis y D. farinae) y la cucaracha Periplaneta americana. La frecuencia de sensibilización a A. aegypti es 65 por ciento. Más de 10 bandas de reactividad cruzada fueron detectadas. Cuatro fueron caracterizadas como: proteína de unión a odorante, citocromo C mitocondrial, ciclofilina (PPIasa) y una proteína de función biológica desconocida (AAEL001668PA). Se analizó la reactividad cruzada entre las tropomiosinas del ácaro (rDer p 10) y rAed a 10.0101 y rAed a 10.0201. Se encontró las tropomiosinas tienen reactividad cruzada con anticuerpos de humanos y ratones, aunque fue mayor entre rDer p 10 y rAed a 10.0101. También se observó que pueden activar los basófilos sensibilizados con rDer p 10. Las tres tropomiosinas indujeron la proliferación de esplenocitos de ratones inmunizados con rAed a 10.0101 o rAed a 10.0201. El mapeo de epítopos utilizando 28 péptidos solapantes que cubrían la secuencia de Aed a 10.0101 reveló cinco regiones de aminoácidos que contienen epítopos T implicadas en esta reactividad cruzada. En conclusión, A. aegypti es una fuente importante de alérgenos que pueden jugar un papel en la sensibilización y exacerbación de las alergias. Varios alérgenos están involucrados en estos fenómenos y algunos de ellos tienen reactividad cruzada con alérgenos de artrópodos. La reactividad cruzada puede ocurrir a nivel molecular y funcional, involucrando anticuerpos, basófilos y linfocitos T. Los alérgenos de los mosquitos pueden producirse como moléculas recombinantes similares a los alérgenos naturales. rAed a 8 indicaron puede tener un papel inmuno regulador intrínseco.