Identificación y caracterización del componente proteico de la especialidad farmacéutica Inmunoferon®

Resumen

Inmunoferon (copyright) es un fármaco inmunoregulador de origen natural que presenta actividad por vía oral. Su uso está recomendado en el tratamiento de enfermedades muy diversas de origen inflamatorio y/o infeccioso crónico. Está constituido por la asociación no covalente de polisacáridos procedentes de Candida utilies con proteínas obtenidas a partir de semillas no germinadas de ricino (Ricinus communis). Hasta la fecha, su composición específica era desconocida lo que ha impedido estudiar en profundidad su compleja farmacología y establecer las bases fisicoquímicas de su capacidad para mantener la actividad por vía oral. Esta tesis doctoral consta de dos bloques claramente diferenciados. En primer lugar, se ha llevado a cabo el aislamiento, identificación y caracterización molecular de los polipéptidos integrantes del componente proteico de Inmunoferon, y se ha realizado una caracterización por dicroísmo circular de sus propiedades estructurales. Los resultados obtenidos en este primer bloque han permitido determinar que la fracción proteica de Inmunoferon está constituida esencialmente por las proteínas de reserva del ricino Ric c 3 y Ric c 1. Estas proteínas pertenecen a la familia de las albuminas 2S y constan de dos subunidades de distinto tamaño unidas por dos puentes disulfuro. Por otra parte, el estudio estructural permitió establecer que ambas proteínas poseen un plegamiento nativo virtualmente idéntico, con predomino de hélice. Además, se comprobó que su estructura secundaria presenta una gran estabilidad conformacional frente a la desnaturalización inducida por agentes químicos, temperatura o pH. También se demostró que son proteínas resistentes a la acción digestiva de pepsina, tripsina y quimotripsina. En conjunto, estos resultados indican que Ric c 3 y Ric c 1 son capaces de atravesar el tubo digestivo sin sufrir modificaciones significativas en su estructura, lo que explicaría la capacidad de Inmunoferon para ejercer su acción farmacológica tras la administración por vía oral. En segundo lugar, la proteína Ric c 3 se ha clonado y producido en una cepa de E.coli supersecretora, desarrollada a largo de los trabajos experimentales que llevaron a la elaboración de esta tesis. Esta cepa se caracteriza por ser capaz de crecer en medio de cultivo mínimo con una única fuente de nitrógeno y de carbono, y simultáneamente sobreproducir proteína heteróloga y secretarla al medio de cultivo. La proteína recombinante Ric c 3 se ha purificado a partir del medio extracelular mediante un procedimiento desarrollado a tal fin consistente en dos etapas de precipitación y dos etapas cromatográficas, con un alto rendimiento (20 mg por litro de cultivo celular). Se ha caracterizado molecular y estructuralmente, demostrándose su equivalencia con la proteína natural. Además, la nueva cepa ha posibilitado la obtención de preparaciones de proteína recombinante etiquetada con 15N con homogeneidad adecuada para la determinación de su estructura tridimensional a alta resolución mediante RMN, algo que no se había conseguido hasta ahora con proteínas de la familia purificadas a partir de semillas