Obtención de péptidos alimentarios mediante hidrólisis enzimática con efectos sobre la salud intestinal

Resum

En la presente Tesis Doctoral, se estudió la obtención e identificación de péptidos alimentarios mediante el uso de hidrólisis enzimática y el efecto sobre algunos aspectos relacionados con la salud gastrointestinal. Se analizaron distintos hidrolizados y digeridos gastrointestinales de caseínas, proteínas de suero lácteo y lunasina. La secuenciación y cuantificación de los péptidos se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem RP HPLC MSMS y su actividad biológica se evaluó en modelos celulares y animales. Se evaluó si un subproducto industrial de caseína generado durante la fabricación de un ingrediente funcional podría servir como sustrato para la producción de caseinofosfopéptidos CPPs. La identificación y semicuantificación de CPPs tras la hidrólisis del subproducto con tripsina revelaron cambios cualitativos y cuantitativos en los CPPs generados con distintas condiciones de tiempo de hidrólisis y pH. La comparación de los péptidos resultantes de los hidrolizados trípticos y de la simulación de la digestión gastrointestinal mostró gran homología en las secuencias de CPPs y los péptidos descritos anteriormente en modelos in vivo e in vitro. Estos resultados sugieren que el subproducto podría ser empleado como fuente de CPPs para favorecer la absorción de minerales a nivel intestinal sin necesidad de hidrólisis previa. También se prepararon hidrolizados de proteínas de suero lácteo con enzimas de grado alimentario Alcalasa, pancreatina y Flavourzyme. Los hidrolizados se sometieron a cromatografía de afinidad con Fe III inmovilizado, y los péptidos unidos se secuenciaron mediante RP HPLC MSMS. Se observó que independientemente de la enzima utilizada, los dominios de BLg YVEELKPTPEGDLEILLQ y TPEVDDEALEKFD, englobaron la mayoría de los péptidos identificados, siendo por tanto, estas regiones las responsables de la unión al Fe. Asimismo, se evaluó el efecto sobre la producción de mucinas, en células caliciformes intestinales humanas HT29MTX, de los péptidos de as1 caseína RYLGY, AYFYPEL, YFYPEL, de as2 caseína YQKFPQY y del hidrolizado de caseína que los contiene. Las secuencias AYFYPEL e YFYPEL aumentaron significativamente la expresión del gen de MUC5AC, logrando incrementos cercanos a 1,7 veces la expresión basal tras 4 horas de exposición. El hidrolizado de caseína mostró un mayor efecto sobre la secreción de mucinas que los péptidos AYFYPEL e YFYPEL ensayados individualmente. Por tanto, es probable que otros péptidos o componentes presentes en el hidrolizado contribuyan en la síntesis de mucinas. Posteriormente, se evaluó la actividad antiulcerogénica in vivo de este hidrolizado de caseína, en comparación con la caseína de partida, y de un hidrolizado de proteínas de suero enriquecido en BLg empleando un modelo de úlceras inducidas por etanol absoluto en ratas Wistar. Todas las muestras ensayadas a dosis entre 300 y 1000 mg por kg de peso corporal, ejercieron un efecto protector frente a la aparición de lesiones ulcerativas. Además, se encontró un efecto dosis dependiente para ambos hidrolizados enzimáticos. Finalmente, se estudió el comportamiento de la lunasina en condiciones que simulan la digestión gastrointestinal en presencia del isoinhibidor1 de Bowman Birk IBB1. El efecto protector del IBB1 frente a la hidrólisis de lunasina por pepsina fue independiente de la proporción de isoinhibidor y lunasina presente, mientras que el efecto protector frente a la tripsina y la quimotripsina sí mostró un efecto dosis dependiente. Los digeridos obtenidos al final de la simulación de la digestión gastrointestinal de la lunasina disminuyeron la viabilidad celular en cultivos de células HT29 y Caco2. Por tanto, la hidrólisis enzimática permitió obtener una amplia gama de péptidos alimentarios capaces de ejercer distintas funciones fisiológicas, relacionadas con la absorción de minerales y la protección del epitelio intestinal.