Aplicación del sistema de recombinación específica de secuencia ß-six al estudio de la regulación de la expresión génica en células eucariotas y modelos animales

Resumen

Las recombinasas específicas de secuencia son herramientas muy valiosas en la generación de modificaciones génicas condicionales. Permiten controlar la recombinación de forma específica de tejido o tiempo, sorteando las limitaciones de los sistemas de knockout convencionales. Actualmente los sistemas Cre y Flp son los más empleados. La necesidad de realizar modificaciones más complejas en un mismo organismo hace que sea primordial caracterizar otras recombinasas que complementen a las existentes. La beta recombinasa necesita un sustrato superenrollado y un cofactor de la reacción, como Hbsu o HMG1. Se ha demostrado que la beta recombinasa cataliza resolución o inversión en células eucariotas, tanto de sustratos episomales como integrados. Hemos determinado que la tasa de recombinación mediada por la beta recombinasa no se ve afectada por la deficiencia en el cofactor HMG1. Este y otros datos confirman que en el entorno eucariota hay otras proteínas accesorias que pueden actuar de cofactores y que estas reacciones pueden ocurrir en la mayor parte de tejidos y tipos celulares. Para evaluar el potencial de la beta recombinasa en eucariotas desarrollamos un sistema de RAGE. Este sistema ha resultado funcional. También hemos generado un vector retroviral que porta la proteína de fusión betaEgfp, permitiendo la integración y expresión de nuestra proteína. Para estudiar la eficacia de la recombinación en sustratos integrados hemos obtenido clones estables al sustrato de RAGE y en ellos hemos introducido la beta Egfp. Analizamos la recombinación. La mayoría de los clones mostró una alta recombinación, pero no todos. Para determinar si la falta de recombinación era por inaccesibilidad del sustrato, insuficiente expresión de la enzima o bien por un proceso reversible de recombinación, analizamos la recombinación en varios subclones, que tenían diferente dosis de recombinasa. Los resultados apuntan a una dependencia de la expresión de la recombinasa, pues los niveles proteicos se correlacionaron con los niveles de recombinación y los de expresión del marcador. Generamos un sistema inducible de recombinación usando el LBD del receptor de andrógeno, AR. Hemos generado dos proteínas de fusión, una doble betaLBD y otra triple betaEgfpLBD, y hemos evaluado su expresión, localización y capacidad de recombinación tras la adición del ligando. Ambos sistemas pueden regular la actividad recombinasa, destacando que la proteína doble ofrece un mayor control basal, mientras que la triple muestra mayores niveles de inducción. Para evaluar el potencial del sistema beta six en los modelos murinos desarrollamos dos líneas sustrato. Una línea que llevaba un casete de RAGE, Tgrec, y una línea KO que llevaba el casete sustrato sustituyendo el enhancer del TCRbeta, KOsix. La línea murina transgénica a la beta recombinasa bajo el promotor proximal de Lck,Tgbeta, ya había demostrado expresar la beta recombinasa de forma funcional y específica de tejido. La línea doble transgénica TgrecTgbeta confirmó la expresión selectiva de beta recombinasa. En los análisis por PCR la banda de recombinación fue detectada en los órganos linfoides y las poblaciones linfocitarias T, confirmando que la beta recombinasa es activa exclusivamente en timo, bazo y ganglios. De los linfocitos T la máxima recombinación se obtuvo en SP, siendo la banda no recombinada muy minoritaria. La actividad beta recombinasa en linfocitos T periféricos fue muy alta, siendo difícil de detectar el sustrato en su forma no recombinada. En la línea KOsix, se verificó la capacidad de recombinación de las ES tras su electroporación con la beta recombinasa. En la línea doble transgénica KOsixTgbeta la presencia de la banda de recombinación se analizó por PCR. Los resultados mostraron claramente la banda de recombinación exclusivamente en los órganos de expresión de la beta recombinasa. En los linfocitos T SP de órganos linfoides secundarios se alcanzó la práctica totalidad de sustrato recombinado.