Desarrollo de métodos moleculares para la detección y tipificación de cepas de levaduras con interés industrial

Resumen

El objetivo general de esta Tesis es el desarrollo de métodos moleculares para la detección y tipificación de cepas de levadura que sean rápidos, económicos y, sencillos de aplicar en la industria alimentaria. Además, como demostración de la utilidad de los métodos desarrollados, se analiza su aplicación a un caso de deterioro de yogures ecológicos. Las especies seleccionadas interesan como deteriorantes de alimentos, cultivos iniciadores, agentes de biocontrol o en el ámbito sanitario. Para un control adecuado, es tan importante identificar las especies como diferenciar las cepas mediante un método de tipificación adecuado. En el género Zygosaccharomyces se clasifican especies como Z. bailii, Z. mellis y Z. rouxii que son capaces de contaminar y deteriorar alimentos con una baja aw. Destacamos que el método (IGS-PCR RFLP) que hemos desarrollado permite diferenciar el 100 por ciento de las cepas de Z. mellis y Z. rouxii. Además, las cepas de Z. rouxii (CECT 11932 y CECT 10425) que se agrupaban con las cepas híbridas (NCYC1682, NCYC3060 y NCYC1682) podrían ser cepas híbridas según nuestros resultados. Basándonos en la secuencia del dominio D1/D2 26S del rDNA y de las copias divergentes de la región 5,8S-ITS del rDNA, las copias de los genes SOD2 e HIS3 y del resultado obtenido con los cebadores especie-específicos, planteamos la hipótesis de que la cepa CECT 11923 es un híbrido entre Z. rouxii y Z. sapae, mientras que la cepa CECT 10425 sea un híbrido entre Z. pseudorouxii y Z. sapae. Para evitar los errores de interpretación debidos a las especies parentales la detección de las cepas híbridas es muy importante. Por ello, basándonos en las diferencias en la región IGS1 diseñamos cebadores específicos (HibZF/HibZR) para la detección de híbridos de Zygosaccharomyces. Debaryomyces hansenii presenta gran interés industrial por su contribución al madurado y las características organolépticas de algunos alimentos fermentados. La secuenciación no es una técnica de aplicación rutinaria a gran escala en las industrias y la dificultad de conseguir una identificación exacta hace que muchas cepas de D. fabryi o D. subglobosus sean identificadas, mediante otras técnicas, como D. hansenii. Los cebadores (DhPADF/ DhPADR) que hemos diseñado permitieron obtener un producto de amplificación en el 100 por ciento de las cepas de D. hansenii, pero no así en D. fabryi ni D. subglobosus, ni en ninguna de las cepas de otras especies usadas como control. Meyerozyma guilliermondii se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y figura entre las 17 levaduras ascomicetas causantes de infecciones. Sin embargo, no hay un método adecuado para la tipificación de cepas. Hemos analizado diversas técnicas y la detección de microsatélites fue muy discriminante. El estudio in silico nos permitió diseñar cebadores, de los cuales cuatro amplificaron siempre los microsatélites (Sc15, Sc22, Sc32, Sc72) sólo en cepas de M. guilliermondii pero no en las especies indistinguibles fisiológicamente (M. caribbica y Candida carpophila), ni en D. hansenii, también muy parecida. La combinación de los cebadores (Sc15F/R, Sc32F/R y Sc72F/R) da lugar a patrones específicos sólo para las cepas confirmadas como M. guilliermondii. La aplicación de éste método a un caso de deterioro de yogures ecológicos deteriorados (hinchados) o no y, que presentaban altas cargas de contaminación por M. guilliermondii, permitió demostrar que la fuente de contaminación eran las mermeladas. Nuestro análisis demuestra que la contaminación de los yogures naturales puede pasar desapercibida para la industria y el consumidor ya que sólo aparecían deteriorados los que incluyen azúcares fermentables (mermeladas). Más aún, la contaminación queda más enmascarada porque la fermentación, pero no el crecimiento, se inhibe fuertemente a 8ºC.