Modulación de la formación y de la diversidad estructural de amiloides

Résumé

Los amiloides han adquirido la denominación de estado estructural provisto de actividad funcional. Su estabilización requiere la presencia en la cadena de regiones adhesivas o proamiloidogénicas capaces de formar una lámina ß cruzada, la reactivación de éstas por exposición al medio y una concentración superior a un umbral que contrarreste la barrera entrópica asociada a la adquisición del orden fibrilar. Estos requisitos dibujan un proceso de formación en varias etapas y la existencia de factores reguladores tanto intrínsecos como extrínsecos. Dentro de estos factores, se encuentran las mutaciones metabólicas derivadas de la sustitución de Met por SeM, los códigos contenidos en la estructura de las cargas y los cambios drásticos de entorno que permitan la ganancia o pérdida de un ligando estructural. Para determinar el papel de la sustitución de Met por SeM, o mutación metabólica en el ensamblaje de amiloides se eligieron regiones con un (Aß40, M35) o varios (HuPrP106 a 140; M109, M112, M129, M134) residuos. Estas secuencias se sintetizaron empleando métodos en fase sólida, y su capacidad para formar amiloides y la naturaleza de éstos se analizó utilizando cinéticas de unión de ThT, medidas de solubilidad (PAGE,SDS), dicroísmo circular (CD) y microscopía de fuerzas (AFM); determinando su funcionalidad mediante citotoxicidad. En el caso de Aß40, la sustitución de M35 por SeM impide la formación de fibras amiloides y da lugar a agregados no tóxicos tanto en reacciones homo ((SeM35)Aß40 con (SeM35)Aß40) como heteroasociación ((SeM35)Aß40 con (M35)Aß40). En el caso de HuPrP106 a 140, las sustituciones posibles originan un abanico de efectos desde la inhibición (SeM129), la aceleración (SeM109 y SeM112), la reducción del rendimiento (SeM134), y cambios de forma, todos ellos correlacionados con alteraciones en la actividad citotóxica. Para determinar el papel de la estructura de las cargas en la formación de amiloides, se eligió la cadena de PrP, en ésta la carga presenta una distribución peculiar. El dominio N terminal repetitivo está flanqueado por dos regiones polibásicas CC1 (23 a 30) y CC2 (101a110), mientras que el dominio C terminal contiene todos los residuos ácidos, algunos expuestos. Para determinar el papel de la carga superficial en la formación y propiedades del estado amiloide de PrP, se generaron a partir de HaPrP(23a230) wt los mutantes K2(K24E,K27E), K4(K101,104,106,110E), K6 (K2 y K4), K2 y E200K, E200K, Q217R, Q219K, E221K y PrP¿23a89. Las cadenas recombinantes se caracterizaron empleando dispersión dinámica de luz (DLS), CD, AFM y microscopía de fluorescencia, las expresadas en células CHO mediante transfección transitoria se emplearon en estudios de procesamiento por desglicosilaciones enzimáticas e inmunodeteccion con westernblot. La caracterización de la forma ¿ (PrPC) indicó la existencia de un estado abierto y otro compacto más estable, su conversión depende de una interacción entre dominios, mediada por CC1 y la superficie electronegativa de ¿3. Esta interacción dificulta la ruta de formación de amiloides. Además, la estructura de la carga juega un papel clave en el estado amiloide, determinando estructura y reactividad superficial. El efecto de los cambios drásticos de entorno que incluye alteraciones en la unión de ligandos estructurales se estudió empleando la proteína rGad m1 que une Ca2+, alérgeno dominante de pescado, y condiciones que simulan el tránsito gastrointestinal. Se emplearon análisis teóricos de secuencia y medidas de unión de ThT, SDSPAGE, CD, DLS, AFM, proteólisis y dotblot. Los resultados obtenidos indicaron que Gad m1 forma amiloides a partir de su forma apo, estabilizada en entorno gástrico o en presencia de quelantes. Estos amiloides generan la resistencia a proteasas y a la formación de distintos estados oligoméricos, de los cuales las oligoméricas tipo 2 dan cuenta de la unión de IgE de sueros de pacientes alérgicos al pescado