Caracterización estructural y funcional de la glucosaminidasa LytB de "Streptococcus penumoniae""

Resumo

LytB es una murein hidrolasa no lítica codificada por Streptococcus pneumoniae, localizada en los polos de la célula y responsable de la separación de las células hijas. Consta de un módulo de unión a colina (CBM) que reconoce la fosforilcolina de los ácidos teicoicos de neumococo, esencial para la catálisis. Además contiene un módulo SH3b y uno de tipo WW, importantes para el reconocimiento del sustrato y la adhesión a las células del hospedador, y un módulo perteneciente a la familia GH73 de las glicosil hidrolasas, responsable de su actividad catalítica. A pesar de ser un factor de virulencia implicado en la colonización de la nasofaringe, la evasión de la respuesta inmune y la formación de biofilms, por lo que podría considerarse una diana potencial en el desarrollo de nuevas vacunas o antibióticos, su actividad catalítica o su especificidad de sustrato no han sido estudiadas. Así, los objetivos de esta tesis han sido la obtención de formas estructuralmente homogéneas, la caracterización de la estabilidad y organización estructural, el estudio de la especificidad de sustrato y la identificación de residuos relevantes para la catálisis. La caracterización de muestras purificadas por cromatografía de afinidad y ultracentrifugación analítica mostró la coexistencia de monómeros y formas de mayor tamaño molecular que se separaron por cromatografía de exclusión molecular. Mediante ensayos de dispersión de células de neumococo de la cepa R6B se verificó que ambas formas eran funcionales. Los estudios de estabilidad térmica (DSC y DC) mostraron que la moderada estabilidad de LytB se veía incrementada tras el reconocimiento y la unión de colina por el CBM y que este efecto era transmitido al módulo catalítico. Estos resultados en combinación con la valoración por ITC de la unión de LytB a análogos de colina permitieron cuantificar la desestabilización que introduce la carga negativa del grupo fosfato. El modelo construido por homología para el módulo GH73 de LytB ha permitido ubicar los residuos ácidos dentro de la estructura e identificar al E585 como el donador de protones en la hidrólisis, cuya implicación en la catálisis se ha demostrado por mutagénesis. Del resto de residuos ácidos localizados en la cara de la cavidad catalítica sólo el D657 contribuye a la eficacia del proceso catalítico. La especificidad de sustrato se analizó mediante HPLC y espectrometría de masas tras la degradación de paredes celulares de diferentes cepas de neumococo. No se detectaron especies N-desacetiladas entre los productos liberados por LytB, que mostró preferencia por muropéptidos con bajo grado de entrecruzamiento y cadenas glicánicas sin sustituir. Los resultados confirmaron así mismo que LytB es una N-acetilglucosaminidasa. El mecanismo de reacción se estudió analizando, mediante HPLC y espectrometría de masas, la capacidad de LytB para hidrolizar compuestos relacionados con componentes del PG. La hidrólisis de oligómeros de N-acetilglucosamina mostró que LytB actúa con retención de la configuración y que, además de quitinasa, presenta actividad glicosil transferasa. La hidrólisis de pequeños muropéptidos mostró que sólo el tetrasacárido GM)2 es reconocido como sustrato. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de los subsitios de unión del centro activo para el reconocimiento del peptidoglicano y, en consecuencia, para la formación de complejos catalíticamente productivos. La identificación de un solo residuo esencial para la catálisis, la incapacidad para hidrolizar muropéptidos desacetilados y que la degradación de oligómeros de GlcNAc tenga lugar con retención de la configuración, indicaría que LytB posee un mecanismo catalítico asistido por el sustrato donde el E585 actuaría como ácido general y el oxígeno carbonilo del grupo N-acetilo de la GlcNAc como nucleófilo.