Diseño racional de peroxidasas ligninolíticas

Resumen

Las peroxidasas ligninolíticas son enzimas producidas por los hongos de podredumbre blanca con gran potencial biotecnológico al ser capaces de oxidar una variedad de sustratos recalcitrantes. Por ello, representan una alternativa sostenible y respetuosa con el medio ambiente en procesos que requieren transformaciones oxidativas para la producción de químicos y otros productos de valor añadido. Sin embargo, algunas de sus propiedades han de ser optimizadas antes de su uso biotecnológico. En la presente tesis, la peroxidasa versátil, VP, de Pleurotus eryngii fue escogida como peroxidasa ligninolítica modelo con los siguientes objetivos: el diseño de una peroxidasa que presente unas características más adecuadas para su aplicación biotecnológica, y la profundización en el conocimiento de las bases estructurales que regulan la catálisis y estabilidad de la VP. En primer lugar, el estudio de la estabilidad oxidativa de la VP demostró que la enzima es susceptible a la inactivación por exceso de peróxido. La sustitución de metioninas, sensibles a condiciones oxidantes, y la modificación de la reactividad de la enzima con el H2O2, conseguida gracias a remodelación del entorno de la histidina distal, permitieron incrementar la estabilidad oxidativa de la VP. Esta mejora se relacionó con un aumento de la estabilidad del compuesto III. En segundo lugar, la transferencia a la VP de motivos estructurales estabilizantes, encontrados en una peroxidasa relacionada que presentaba una elevada estabilidad a pH, mejoraron la estabilidad alcalina y ácida de la enzima. Así, los nuevos puentes de hidrógeno y puentes salinos introducidos en la VP estabilizaron el hemo y su entorno. Además, la introducción de residuos básicos expuestos al solvente, así como el diseño de un puente disulfuro extra en la zona cercana al calcio distal, incrementaron la estabilidad a pH ácido. Esta estrategia de transferencia se presentó como un buen método para el diseño y optimización de biocatalizadores de interés. En tercer lugar, el análisis de la variante evolucionada VP 21B, que presenta una estabilidad y propiedades catalíticas mejoradas, mostró que las nuevas interacciones formadas en esta variante, como consecuencia de la introducción de tres residuos básicos, eran responsables de las mejoras en estabilidad observadas. Los nuevos puentes salinos formados, una conexión extra con el hemo, y la eliminación de interacciones ácido/ácido desfavorables, fueron fundamentales para la estabilización del bolsillo del hemo y mantuvieron la enzima activa bajo condiciones alcalinas moderadas. Por otra parte, la mayor exposición del canal del manganeso en 21B y la mejora en la oxidación de sustratos de bajo potencial redox, promovidos por la introducción de una metionina, sugieren que estos sustratos serían oxidados en el sitio de oxidación de manganeso en la variante 21B. En cuarto lugar, se estudió la transferencia electrónica entre la peroxidasa y la lignina durante la oxidación de ésta, la cual fue relacionada con la presencia de un triptófano superficial que forma un radical catalíticamente activo. Además, el tratamiento de los lignosulfonatos con VP mostró la progresiva degradación de la lignina durante el tratamiento y la tendencia a polimerizar de los productos de degradación. Estos resultados confirmaron la capacidad ligninolítica de la enzima. Finalmente, la mejora de las constates cinéticas en la variante R257A:A260F mostraron que las propiedades del triptófano catalítico son moduladas por residuos del entorno. En resumen, el trabajo llevado a cabo en esta tesis ha permitido profundizar en el conocimiento del mecanismo catalítico de la VP, incluyendo la transferencia electrónica desde el polímero de lignina, así como de las bases estructurales que regulan algunas propiedades de las peroxidasas ligninolíticas como la estabilidad oxidativa o la estabilidad a pH, información importante para el diseño y aplicación de biocatalizadores de interés.