Expresión heteróloga, caracterización y aplicaciones biotecnológicas de la esterol esterasa-lipasa de "Ophiostoma piceae" y de otras enzimas seleccionadas de genomas fúngicos

Resumen

El ascomiceto Ophiostoma piceae secreta una esterol esterasalipasa (OPE) de amplia especificidad de sustrato capaz de hidrolizar tanto triglicéridos como ésteres de esterol. Estudios preliminares pusieron de manifiesto el gran potencial biotecnológico de esta enzima tanto a nivel de hidrólisis como de síntesis, mostrando mayor efectividad que otras enzimas comerciales similares como son las lipasas secretadas por Candida rugosa. En este trabajo se han estudiado distintos sistemas de producción heteróloga con el objetivo de encontrar el más adecuado para OPE. La enzima expresada en Escherichia coli formó cuerpos de inclusión y los intentos de solubilización para obtener una proteína funcional resultaron infructuosos. En contraposición, en el organismo GRAS Saccharomyces cerevisiae se obtuvo proteína activa con todas las construcciones empleadas. La enzima recombinante se caracterizó y se comparó con la previamente expresada en Pichia pastoris, mostrando diferencias a nivel de producción, estado de agregación y propiedades cinéticas. La producción en S. cerevisiae puede abrir las puertas del empleo de esta enzima en el sector alimentario. La falta de expresión funcional de OPE en E. coli podría relacionarse con ciertas modificaciones post-traducionales requeridas para el correcto plegamiento proteico. La resolución de la estructura molecular de OPE en dos conformaciones distintas permitió extrapolar sus principales características: i) la presencia de una tapadera anfifílica, en la forma cerrada, que limita el acceso de los sustratos y cuyo desplazamiento permite la entrada al centro activo; ii) el bolsillo de sustrato en forma de túnel recto que termina próximo a la superficie y que podría servir como vía de salida de los productos de reacción; iii) la organización funcional de la enzima en un homodímero con una cavidad amplia entre ambas moléculas, permitiría la entrada de sustratos voluminosos. La resolución de la estructura tridimensional de OPE permitirá realizar estudios estructura-función para obtener variantes con propiedades mejoradas. Con el propósito de obtener nuevas enzimas similares a OPE se expresaron en P. pastoris tres enzimas de la familia C. rugosa-like pertenecientes a los genomas de Nectria haematococca, Trichoderma reesei y Aspergillus niger, seleccionadas previamente mediante minería de genomas. La comparación de éstas con OPE ha permitido deducir las principales características de esta familia, mostrando semejanzas a nivel de estabilidad, masa molecular y presencia de formas multiméricas en solución. Sin embargo, la versatilidad para hidrolizar triglicéridos y ésteres de esteroles descrita para las isoformas de C. rugosa (CRL) y la mostrada por OPE, no aparece en todas las enzimas caracterizadas en este trabajo, indicando que no es una propiedad común a todos los miembros de esta familia. También se comparó la actividad de OPE, CRL y las enzimas recién caracterizadas en dos procesos de relevancia biotecnológica como la síntesis de polímeros y la producción de ésteres de sitoestanol. En el primer caso , los resultados revelaron la necesidad de largos tiempos de incubación, con todas las enzimas. En el segundo, OPE alcanzó los porcentajes de transesterificación más altos en tiempos muy cortos, mostrándose como la enzima más prometedora para esta aplicación. Por último, se realizó una búsqueda de otras lipasas de interés en genomas fúngicos similares a la lipasa B de C. antarctica (CalB), una de las más empleadas a nivel industrial. Se identificó la secuencia de la lipasa del basidiomiceto Plicaturopsis crispa (PlicB), que se expresó en P. pastoris. Tras caracterizarla, se comparó con CalB mostrando menor efectividad en la hidrólisis de p-nitrofenoles y mayor frente a un análogo de triglicérido. A la vista de los resultados, la minería de genomas se muestra como una alternativa interesante a los métodos de cribado tradicionales.