Caracterización de la interacción entre las proteínas XIAP y FAF1 y su implicación en las vías de apoptosis y del factor nuclear kappaB (NF-kappaB)

Resumen

La apoptosis es un proceso celular estrechamente regulado por el equilibrio entre estímulos nocivos y citoprotectores. Entre los componentes celulares implicados en la citoprotección destaca la proteína XIAP, perteneciente a la familia de las proteínas inhibidoras de apoptosis, IAPs, y único miembro capaz de bloquear directamente a las caspasas efectoras 3 y 7 y a la caspasa iniciadora 9, interrumpiendo la muerte celular dependiente de caspasas. Además, XIAP promueve la expresión de genes de supervivencia mediante la inducción de la vía NF-¿B. La alteración de la actividad de XIAP esta relacionada con numerosas patologías asociadas a la muerte celular programada por lo que el estudio de la modulación de XIAP permitirá comprender su papel en apoptosis y permitirá identificar posibles dianas terapéuticas para su tratamiento. En la búsqueda de nuevos reguladores que controlen su función hallamos la proteína FAF1, una proteína pro-apoptótica que forma parte del complejo inductor de muerte celular, DISC, interaccionando tanto con el receptor Fas/CD95, como con la caspasa 8 y la proteína adaptadora FADD. Además de su función en la vía apoptótica, también es capaz de inhibir la vía prosupervivencia NF-¿B. Hemos corroborado la interacción en células eucariotas mediante inmunoprecipitación de las proteínas endógenas y utilizando mutantes de deleción observamos que la interacción se produce entre los dominios BIR de la proteína XIAP y la región Nt del dominio DEDID de FAF1. Mediante microscopía confocal hemos determinado la colocalización de ambas proteínas en el citoplasma y núcleo, estudiando diferentes índices de solapamiento (Pearson, Manders, M1/M2 y k1/k2). En primer lugar, nuestros resultados de inmunoprecipitación demuestran que XIAP incorpora la molécula ubiquitina a FAF1 mediante su dominio RING, marcándolo para degradación proteosomal. Posteriormente, evaluamos la citoprotección de XIAP en presencia de FAF1 sin y con estímulos nocivos mediante el sistema robotizado de análisis celular InCell, citometría de flujo y valoración de morfología nuclear. Concluyendo que FAF1 no es capaz de alterar en ningún caso el efecto citoprotector de XIAP. Por su parte, XIAP durante el proceso apoptótico inducido por FAF1, disminuye el procesamiento y actividad de las caspasas 3, 7 y 9. Además, hemos descrito que la sobreexpresión de XIAP disminuye la actividad de caspasa 8, mediante su interacción con FAF1. La proteína XIAP es un activador de la vía de supervivencia del factor nuclear ¿B (NF-¿B) a través del complejo XIAP-TAB1-TAK1, que activa el complejo de IKKs. A su vez, FAF1 inhibe la vía, desestabilizando los complejos IKKs y secuestrando el factor de transcripción p65 en el citoplasma, evitando su entrada al núcleo. Hemos comprobado mediante estudios de luminiscencia que la proteína FAF1 no interfiere en la unión de XIAP con TAB1, necesaria para su activación de la vía NF- ¿B. Por su parte, XIAP es capaz de atenuar la inhibición debida a FAF1 mediante la interacción directa de sus dominios BIR, además de mediante su degradación mediada por la unión de ubiquitinas. En conjunto, esta tesis doctoral describe por primera vez la interacción entre FAF1 y XIAP. La proteína FAF1 no altera la capacidad citoprotectora de XIAP si bien, XIAP interfiere en la actividad pro-apoptótica de FAF1 bloqueando las vías caspasa- dependientes. Igualmente, FAF1 no modula la activación de la vía NF-¿B inducida por XIAP en tanto que XIAP regula la inhibición de FAF1 por la interacción directa y por el marcaje con ubiquitinas para su degradación por el proteosoma. Puesto que ambas proteínas se encuentran estrechamente relacionadas en distintas patologías, el mejor conocimiento del equilibrio de estos dos factores ayudará en la búsqueda de nuevas terapias.