Efectos de parámetros ambientales en interacciones compatibles entre plantas y virus de RNA y su relación con los supresores de silenciamiento virales y sus propiedades

Resumen

Esta tesis doctoral se centra en dos puntos, el estudio de los efectos que factores ambientales asociados con el cambio climático, como son el incremento de la temperatura y los niveles de CO2, pueden tener en las interacciones de tipo compatible entre plantas y virus, así como la profundización en el conocimiento que tenemos sobre el HCPro de el virus Y de la patata (PVY). Se estudió como el incremento de la temperatura (30C) y los niveles de CO2 (970 ppm) pueden afectar a las infecciones de plantas de Nicotiana benthamiana por el virus del mosaico del pepino (CMV), PVY y el virus X de la patata (PVX) como vector de expresión. Para ello se analizó como estos factores afectan a la acumulación viral, los síntomas y el funcionamiento de los supresores de silenciamiento de estos virus, comparados con condiciones estándar de 25C y 401 ppm de CO2. Los resultados obtenidos fueron que a 30C la acumulación de PVY y PVX se vio disminuida en torno a la mitad así como los síntomas, mientras que la infección de CMV no se vio afectada. En condiciones de elevado CO2 no se observaron cambios en los síntomas, sin embargo, la acumulación de PVY y PVX se vio ligeramente disminuida en cuanto a cantidad de proteína CP por unidad de superficie foliar, mientras que se observó un ligero ascenso al relativizarlo a cantidad de proteína. Por otra parte, la acumulación de CMV aumentó en un ambiente de alto CO2 tanto relativizando a unidad de superficie como a cantidad de proteína total. Se desarrolló una modificación de la técnica de la agroinfiltración que permitiera la expresión génica a 30C y se observó que tanto HCPro como 2b eran capaces de suprimir el silenciamiento del gen reportero GFP en condiciones de alta temperatura y alto CO2 de forma tan efectiva como lo hacen en condiciones ambientales. De esto se infiere que ninguno de los factores ambientales estudiados es capaz de afectar, al menos por separado, la eficiencia como supresores de silenciamiento viral de los factores virales estudiados, y que por tanto estos son capaces de hacer frente el incremento de la eficiencia de silenciamiento génico observado en plantas a altas temperaturas. Por ello, el efecto negativo en la acumulación viral observado a 30C tanto para PVY como PVX debe ser atribuido a procesos diferentes a un incremento del silenciamiento génico de la planta. La caracterización subcelular de HCPro reveló en células epidérmicas un patrón de distribución uniforme de la fluorescencia por todo el citoplasma. Sin embargo, en algunas células, se observaron patrones adicionales diferentes: un bajo número de grandes inclusiones citoplásmicas amorfas que contenían alfa-tubulina; un patrón de numerosas inclusiones citoplásmicas en forma de puntos pequeños, de tamaño similar distribuido regularmente a lo largo de todo el citoplasma, anclados al retículo endoplásmico cortical y asociado a los microtúbulos del citoesqueleto; y un patrón filamentoso recubriendo los microtúbulos. La observación de este patrón se vio favorecida por la aplicación de ciertos tratamientos. Asimismo, se observaron formas mixtas e intermedias de los últimos dos patrones, lo que sugiere la existencia de una dinámica entre estos patrones, posiblemente influenciada por factores ambientales y/o celulares. No se observó que HCPro se localizase de algún modo asociado con los filamentos de actina o el aparato de Golgi. Para caracterizar los RNAs que pudieran ser unidos por HCPro in vivo se realizó una secuenciación masiva de los mismos. Los resultados demostraron que HCPro unía preferentemente sRNAs de 21 y 22 nt derivados del virus y en menor medida algunos RNAs de tamaños mayores también derivados del virus. Además se observó en aquellos sRNAs de 21 y 22 nt derivados de la secuencia del virus un sesgo en cuanto a contener en el nucleótido de su extremo 5¿ una adenina, hecho que no se observó paro otros tamaños de RNAs derivados de la secuencia viral ni para ningún tamaño de los RNAs de secuencia de la planta.