Análisis de la expresión génica diferencial de células eritroleucemicas resistentes a la diferenciaciónrelevancia de las proteínas del citoesqueleto de actina

Resumen

El desarrollo de resistencias a los fármacos limita la efectividad de los tratamientos en la mayoría de los procesos tumorales. El avance en el conocimiento de los mecanismos moleculares y celulares que provocan esta resistencia permitiría generar nuevas estrategias terapéuticas. En la presente tesis doctoral hemos analizado mediante secuenciación masiva de ARN (ARN-seq) los transcriptomas de una línea celular eritroleucémica, MEL-DS19, capaz de reiniciar el programa de diferenciación celular en presencia de compuestos químicos inductores, y de una línea celular derivada de la misma, MEL-R, que muestra resistencia a la diferenciación. Los resultados revelaron un total de 596 genes expresados diferencialmente con un fold change mayor de dos, de los cuales 486 transcriben con mayor intensidad en MEL-DS19 y 110 en MEL-R. Se ha visto que en las células MEL-R se produce un silenciamiento génico progresivo causado por el aumento de los niveles de metilación de las islas CpG de los promotores respecto a la línea celular MEL-DS19. Los patrones de expresión de enzimas que catalizan la metilación y demetilación del ADN revelaron un aumento de la transcripción de Dnmt1 y una disminución de Tet3 en MEL-R. Estos resultados sugieren que el incremento de la metilación del ADN en células resistentes podría ser inducido por la Dnmt1 coordinado con el descenso de la demetilación por Tet3, que en conjunto resultaría en un silenciamiento de los promotores. Los resultados del análisis del ARN-seq indicaron que durante el bloqueo del proceso de diferenciación celular hay un silenciamiento de genes involucrados en el citoesqueleto de actina, varios de los cuales son específicos del linaje eritroide. Destacan dentro de este grupo los genes que codifican las proteínas tirosina quinasa de Bruton (Btk), Wiskott-Aldrich syndrome (Was) y pleckstrina (Plek). Con el objeto de estudiar las posibles implicaciones de estos genes en la resistencia a la diferenciación celular se realizaron deleciones de Was, Btk o Plek en MEL-DS19 mediante el sistema CRISPR/Cas9. En los dos primeros casos se observaron deficiencias en la organización y polimerización del citoesqueleto de actina en contraposición a los resultados obtenidos cuando se deleciona Plek. Se determinó asimismo la capacidad de la línea resistente para revertir al fenotipo silvestre. Se establecieron transfectantes estables que expresan cada una de las proteínas en células MEL-R. En Was y Btk se observó una recuperación en la organización del citoesqueleto de actina. Se ha demostrado además que Was y Plek regulan la expresión de Btk a nivel transcripcional, de forma acaso independiente a la organización del citoesqueleto de actina. En conjunto, los resultados permiten concluir que la desregulación de los genes implicados en la modulación y polimerización del citoesqueleto de actina está asociada con la adquisición de un fenotipo resistente a la diferenciación celular.