Análisis estructural de la proteína GAPDH de bacterias patógenas Gram-positivas y su función como factor de inmunoevasión

Resumen

Atopobium vaginae es una bacteria Gram-positiva de la familia Corynebacteriaceae, anaerobia, responsable de alrededor del 80% de los casos de vaginosis bacteriana en humanos junto a Gardnerella vaginalis, pudiendo desencadenar complicaciones obstétricas, así como problemas en el embarazo y predisposición a otras infecciones oportunistas. Dado que no se conoce un tratamiento eficaz contra la vaginosis bacteriana, es importante encontrar nuevos compuestos antibacterianos que la erradiquen y eviten posibles recidivas. Como A. vaginae forma biopelículas con G. vaginalis, su nicho es anaerobio y no oxida del todo la glucosa, dependiendo en gran medida de la glicólisis para la obtención de energía. Durante la primera fase de esta ruta se consumen 2 ATP por cada glucosa, mientras que en la segunda fase se producen 4 ATP y 2 NADH, creando un balance neto de 2 ATP y 2 NADH. Durante la primera reacción de la segunda fase la enzima Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se encarga de transformar el gliceraldehído 3-P en 1,3-bis-fosfoglicerato usando NAD como cofactor, consumiendo una molécula de fosfato inorgánico y generando una molécula de NADH. Al actuar justo antes de que se produzca ATP, la GAPDH podría ser usada como una diana de fármacos, de forma que, al inhibirse, A. vaginae consumirá ATP sin poder regenerarlo. Además de su papel glicolítico, se ha observado que GAPDH posee actividad moonlighting que hace que actúe como factor de virulencia al localizarse fuera del citoplasma, donde es capaz de unirse a plasminógeno para invadir tejidos, a mucinas para adherirse a los tejidos, o a proteínas del sistema del complemento para evadir las defensas del hospedador. Recientemente se ha podido comprobar que, durante la infección, la GAPDH de algunos organismos patógenos interfieren con las proteínas C5a, C1q o C3, evitando la activación del sistema del complemento. Uno de los objetivos de este trabajo era descubrir si la GAPDH de A. vaginae (AvGAPDH) podía unir y secuestrar C5a, como ocurre con la GAPDH de Streptococcus pyogenes, y saber si esta capacidad inmunoevasiva se podría generalizar a otras bacterias Gram-positivas que infectan humanos. Por ello, se clonaron, expresaron y purificaron tanto la GAPDH de A. vaginae como las de dos bacterias Gram-positivas anaerobias y patógenas: S. pyogenes (SpGAPDH) y Clostridium perfringens (CpGAPDH). Gracias a los experimentos de ligand blotting, ELISA, entrecruzamiento con el compuesto BMOE e inhibición de la motilidad de neutrófilos se descubrió la interacción entre C5a y AvGAPDH, CpGAPDH y SpGAPDH, demostrando un mecanismo de inmunoevasión que puede ser importante para la supervivencia de los patógenos Gram-positivos. Tras purificarlas, se cristalizaron y se resolvieron sus estructuras a 2,19 angstroems (AvGAPDH), a 2,5 angstroems (CpGAPDH) y a 1,5 angstroems (SpGAPDH) para estudiar las zonas importantes para cumplir su función y que pueden ser usadas como dianas de fármacos. Para encontrar posibles inhibidores que no se unan a la GAPDH del hígado humano y evitar una pérdida de eficacia, se compararon las estructuras de AvGAPDH, CpGAPDH y SpGAPDH con la GAPDH del hígado humano. También se compararon con las de organismos tripanosomátidos patógenos, ya que poseen diferencias que se han explotado para diseñar fármacos selectivos. Por otro lado, también se probó el efecto inhibitorio de algunos compuestos naturales que por su parecido con el NAD podían inhibir AvGAPDH, CpGAPDH y SpGAPDH.