Desarrollo de protocolos bioseguros de edición génica para la corrección de la epidermólisis bullosa distrófica recesiva

Resumen

La Epidermolisis Bullosa Distrófica Recesiva (EBDR) es una grave enfermedad de fragilidad cutánea caracterizada por ampollas cutáneas generalizadas, deformidades de pies y manos y una alta predisposición al desarrollo de carcinomas epidermoides. No existe aún un tratamiento efectivo para esta enfermedad. La forma más grave de todas las epidermolisis bullosas, la EBDR severa generalizada (EBDR sev-gen) se caracteriza por la ausencia total de colágeno tipo VII, componente principal de las fibrillas de anclaje que unen la epidermis a la dermis, debido a mutaciones nulas en COL7A1, el gen que codifica para este colágeno. Una mutación en el exón 80 de este gen (c.6527insC), que provoca la alteración de la pauta de lectura del ARN mensajero, se ha descrito en un alto porcentaje de los casos de EBDR estudiados en España (46%). La alta prevalencia de esta mutación justifica el desarrollo de una terapia personalizada para estos pacientes basada específicamente en la corrección clonal de esta mutación. Los protocolos de terapia génica clonal basados en la manipulación precisa de células madre epidérmicas requieren el empleo de herramientas moleculares de edición génica altamente eficientes. En este trabajo, hemos combinado vectores adenoasociados (AAV) para la introducción de un ADN molde, con vectores adenovirales para la expresión de nucleasas TALEN con el objetivo de abordar la corrección de la mutación c.6527insC. Después de la transducción con ambos vectores virales, encontramos altas frecuencias de reparación dirigida por homología (HDR) en clones de queratinocitos inmortalizados derivados de un paciente EBDR homocigoto para la mutación c.6527insC. Los clones editados presentaron recuperación de la expresión del transcrito de COL7A1 y de la correspondiente proteína a niveles fisiológicos. Aunque la corrección de la mutación c.6527insC por recombinación homóloga es factible en queratinocitos de paciente inmortalizados, requiere el aislamiento y genotipado de clones resistentes al antibiótico de selección, una difícil tarea cuando se trabaja con células madre epidérmicas derivadas de paciente. En este trabajo, hemos demostrado que la reparación mediante el mecanismo de NHEJ de las roturas de doble cadena generadas por las TALENs resulta en la introducción de indels en una gran proporción de los clones de queratinocitos genotipados. Pequeñas deleciones en la secuencia del exón 80 originan transcritos que codifican cambios limitados en la secuencia aminoacídica y deleciones más grandes que implican la eliminación de las señales de splicing conducen a la síntesis de transcritos carentes de la secuencia correspondiente a los 12 aminoácidos del exón 80. Dada la factibilidad de esta estrategia para la corrección de la EBDR y teniendo en cuenta que la reparación por NHEJ ocurre con mucha más frecuencia que la corrección por recombinación homóloga, hemos abordado la edición de COL7A1 en clones de células madre epidérmicas (holoclones). En este trabajo demostramos que la edición de este gen por NHEJ en clones individuales de células madre derivadas de paciente es posible. La corrección de este tipo celular ofrece la mejor opción para la generación de equivalentes de piel trasplantables con potencial terapéutico para los pacientes con EBDR.