Estudio del papel de las interacciones eph-ephrin en los microambientes de médula ósea en la leucemia linfática crónica

Zusammenfassung

La leucemia linfática crónica se caracteriza por la presencia de linfocitos B maduros anormales que expresan los marcadores CD5, CD20 y CD23. La infiltración de la médula ósea (MO) tiene lugar en todos los pacientes desde el inicio de la patología siguiendo distintos patrones que pueden asociarse con pronóstico. En términos de evolución clínica es una enfermedad muy heterogénea por lo que la búsqueda de nuevos marcadores pronóstico sigue siendo un reto. La acumulación de las células LLC en los tejidos aumenta su resistencia a mecanismos de apoptosis. Un número creciente de estudios sostienen que otros tipos celulares no tumorales dentro del nicho tumoral proveen las señales necesarias a las células LLC y presumiblemente, ellas mismas podrían ser capaces de modificar las propiedades del microambiente en su favor. La familia de receptores tirosina quinasa Eph y sus ligandos, ephrin, regula la adhesión y repulsión celular a través de contactos directos intercelulares siendo evidente su importancia en hematopoyesis y cáncer. Nuestros resultados previos habían descrito la presencia de miembros de esta familia en sangre periférica (SP) de pacientes LLC. Pensamos que una posible expresión diferencial entre SP y MO podría asociarse con características clínicas de la enfermedad y su patobiología. La cuantificación de estas moléculas a nivel de ARN mensajero mostró que ephrinB2 era el miembro más abundante en las células LLC de MO y el único que se encontraba claramente sobre expresado respecto al compartimento de SP. El análisis por citometría de flujo mostró además la existencia en MO de una subpoblación con expresión elevada de ephrinB2, ausente en SP. La expresión de ephrinB2 en la población LLC mayoritaria y el porcentaje de células ephrinB2hi correlacionaba con factores de peor pronóstico como genes IGVH no mutados o positividad para ZAP70. Además la proporción de células ephrinB2hi disminuía significativamente en muestras con patrón de infiltración difuso. Al caracterizar los linajes celulares obtenidos en cultivos de aspirados de MO de pacientes confirmamos que el tipo mayoritarios se correspondía con células adherentes de fenotipo mesenquimal (BMMSC). En comparación con las obtenidas de donantes sanos, las BMMSC LLC presentaban una expresión incrementada de EphB4 y otras moléculas pro supervivencia (CXCL12, BAFF, APRIL y VCAM1). La subpoblación ephrinB2hi poseía características diferenciales respecto al resto de las LLC de MO: elevada expresión de las integrinas, disminución de CXCR4 y Bcl2 incrementado; mientras que no expresaban el marcador de proliferación Ki67. Estas células mostraron una adhesión preferente a las BMMSC, más aún demostramos que el contacto directo entre ambos tipos celulares era fundamental para la supervivencia de las LLC. La inducción de la señal forward a través de EphB4 en el estroma induce la liberación al medio de BAFF y APRIL, que sostienen la supervivencia de las células LLC. Observamos agregados de células LLC de MO solas, con elevada expresión de ephrinB2 en los sitios de contacto. El silenciamiento de esta molécula disminuía su viabilidad en ausencia de otros estímulos, apuntando al papel de interacciones homotípicas. La inducción de las señales forward y reverse en las LLC aumentaba la producción de BAFF y APRIL, pero sólo la señalización a través de ephrinB2 incrementaba la expresión de TACI. La adición de formas exógenas de BAFF y APRIL aumentaba la viabilidad de las LLC cultivadas sobre EphB4Fc en condición control o tratadas con fármacos citostáticos. Nuestros resultados sostienen la existencia de dos nichos funcionalmente distintos en el microambiente de MO de la LLC. En los primeros estadios las LLC ephrinB2hi interaccionan fuertemente con las BMMSC, generando un microambiente favorable para la expansión tumoral al aumentar la producción de BAFF y APRIL. Al avanzar la enfermedad, las LLC sostienen su supervivencia mediante mecanismos autocrinos que también involucran a la familia del TNF.