Metalotioneínas de Tetrahymenabiodiversidad molecular, adaptación a metales, cepas Knockout y/o Knockdown y potencial utilización en biorremediación

Abstract

Uno de los objetivos de esta tesis es ampliar nuestro conocimiento sobre la biodiversidad molecular de los genes MT del género Tetrahymena y su respuesta frente a las condiciones de estrés. Se han aislado los ADNc de 12 nuevas CdMTs y 9 CuMTs en cinco especies del género Tetrahymena hasta el momento no exploradas: T. patula, T. borealis, T. americanis, T. malaccensis y T. elliotti. El análisis comparativo de todos ellos nos ha permitido corroborar la subdivisión de la familia 7 en dos subfamilias: 7a o CdMTs y 7b o CuMTs, que se diferencian principalmente en: su patrón de Cys, la diferente proporción entre los aminoácidos Lys y Cys, el carácter modular de las CdMTs, la asimetría en el uso de codones que codifican el aminoácido glutamina y su inducción preferente por Cd2+ o Cu2+. Los perfiles de expresión de algunos de estos nuevos genes MT se han analizado mediante RT-PCR cuantitativa tras la exposición de los cultivos celulares a diferentes condiciones de estrés, confirmándonos el carácter multiestrés de las MTs. Otro objetivo importante ha sido analizar la respuesta celular del ciliado T. thermophila frente a un estrés extremo por metales. Se han aislado y caracterizado tres cepas adaptadas a concentraciones crecientes de metal, capaces de tolerar concentraciones máximas de 115 µM Cd2+, 4 mM Cu2+ ó 5,5 mM Pb2+. Su caracterización morfológico-estructural mediante microscopía confocal de fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión nos ha revelado estrategias de adaptación muy diferentes en cada una de ellas. En la cepa adaptada al plomo destaca la presencia de múltiples acúmulos electrodensos de gran tamaño que contienen plomo. Este eficaz proceso de bioacumulación descrito en esta cepa hace de ella una buena candidata para llevar a cabo procesos de biorremediación en ecosistemas contaminados por metales. La respuesta de T. thermophila a la presencia de metales también se ha estudiado utilizando varias cepas knockout (KO) y/o knockdown (KD) para los genes MTT1 y/o MTT5. El gen MTT5, a diferencia de todos los demás genes MT conocidos hasta la actualidad, se ha revelado como un gen esencial, ya que no fue posible obtener una cepa KO estable para este gen. La reducción hasta niveles mínimos del número de copias/µl de este gen esencial parece que se compensa en la cepa MTT5KD con la formación de nuevas isoformas génicas de metalotioneínas, generadas mediante procesos de recombinación homóloga a partir de dos copias del gen MTT1 original. Estas nuevas isoformas son funcionalmente activas y capaces de sobre-expresarse en respuesta a la presencia de Cd2+. El análisis comparativo de los niveles de expresión de los genes MT realizado en diferentes cepas de T. thermophila nos ha aportado nueva y valiosa información sobre las funciones específicas que presentan cada una de las isoformas MT así como su relevancia bajo condiciones de estrés por metales. Además, nos ha mostrado la posible existencia de un proceso de co-regulación transcripcional entre algunos de estos genes MT. El cálculo del número de copias/µl de los genes MT en las diferentes cepas de T. thermophila nos ha permitido relacionar la adaptación al Cd2+ con un proceso de amplificación diferencial relativamente rápido y reversible que afecta a todo el subfragmento cromosómico macronuclear en el que se localizan los genes MTT1 y MTT3. La expresión de los genes MT de Tetrahymena probablemente se regula a nivel transcripcional mediante los factores AP-1 (superfamilia bZIP). En cada una de las cuatro especies de Tetrahymena analizadas hemos descrito cuatro factores de transcripción bZIP altamente conservados. El estudio comparativo de los niveles de expresión de los cuatro factores AP-1 en T. thermophila nos indica que éstos posiblemente participan en la regulación de la expresión de los genes MT bajo el estrés por metales. Se ha elaborado un modelo que trata de explicar la función reguladora de cada uno de los factores AP-1 en la respuesta a estrés por metales.