Papel de SRC-quinasas en invasión y de micrornas en resistencia a quimioterapia en células de melanoma

Resumen

La migración de células de melanoma estimulada por quimioquinas depende de la señalización mediada por proteínas G heterotriméricas G¿12/13 y de la GTPasa RhoA. La estimulación de G¿13 provoca la activación de p190RhoGAP y la posterior inhibición de RhoA, lo que bloquea la invasión celular. Actualmente, uno de los tratamientos contra el melanoma metastásico se basa en inhibidores específicos frente a BRAF mutado, sin embargo invariablemente se generan resistencias. Dada la importancia de los miRNAs en los procesos oncogénicos, se analizó su potencial participación en la resistencia a vemurafenib de células de melanoma. Objetivos -Análisis de la contribución de la vía de señalización G¿13-p190RhoGAP-RhoA en la invasión de células de melanoma. -Generación y caracterización de células de melanoma resistentes a inhibidores de la vía de las MAP-quinasas. -Análisis de la implicación de miRNAs en la resistencia a vemurafenib de células de melanoma. Metodología Para el primer objetivo se ha realizado una aproximación experimental basada en el silenciamiento específico mediante siRNAs o sobre-expresión de proteínas implicadas en la vía de señalización estudiada, seguido de ensayos de co-inmunoprecipitación, de actividad GTPasa o de invasión celular. Para el segundo y tercer objetivo las líneas celulares de melanoma generadas resistentes a inhibidores de la vía de las MAP-quinasas se han caracterización mediante ensayos de viabilidad, proliferación y western blot. Asimismo, se ha realizado RNA-Seq para determinar el papel de miRNAs en la resistencia a vemurafenib, además de generarse transfectantes con sobre-expresión o silenciamiento estable de determinados miRNAs que se analizaron en ensayos de viabilidad, proliferación, western blotting y qPCR. Resultados La Src quinasa Blk está implicada en la fosforilación en tirosinas de p190RhoGAP en células de melanoma que expresan G¿13 activo. La activación de G¿13 promueve la disociación de Blk del complejo G¿13-Blk y su posterior unión a p190RhoGAP, mediando la fosforilación de esta GAP, que a su vez correlaciona con una mayor unión RhoA-p190RhoGAP y disminución de la actividad de RhoA, provocando finalmente la inhibición de la invasión celular estimulada por CXCL12. Por otra parte, las células A375 resistentes a vemurafenib (A375-VR) exhiben una mayor activación de Ras, lo que correlaciona con el aumento de la activación de la vía de señalización de las MAP-quinasas y de la vía PI3-quinasa/AKT. Por otra parte, las células resistentes a trametinib tienen en común una mayor activación de PI3-quinasa/AKT. Las células A375-VR mostraron aumento en la expresión de miR-204-5p y miR-211-5p y disminución de miR-140-3p en comparación con las células parentales. Estas alteraciones son estables, y su expresión se modifica en respuesta a vemurafenib en células de melanoma con mutación en BRAF V600E. El tratamiento con otros inhibidores de la vía de las MAP-quinasas genera cambios similares en la expresión de estos miRNAs en células A375. Notablemente, los transfectantes que sobre-expresan miR-204-5p o miR-211-5p presentan un aumento de viabilidad y proliferación celular en presencia de vemurafenib. En conjunto, los resultados sugieren que la tolerancia temprana al vemurafenib de las células A375 implica cambios en la expresión de miR-204-5p y miR-211-5p, lo que podría contribuir a las primeras etapas de la resistencia. Conclusiones Los resultados de la presente Tesis muestran la relevancia de Blk en la regulación de la vía G¿13-p190RhoGAP-RhoA, la cual está implicada en la migración e invasión de células de melanoma. La identificación y caracterización de los microRNAs miR-204-5p y miR-211-5p como elementos que contribuyen a la resistencia de células de melanoma a vemurafenib podrían ayudar al diseño de futuras terapias para el tratamiento del melanoma metastásico.