Nuevas oxidorreductasa gmc de basidiomicetos ligninoliticosscreening genómico, mecanismo catalítico y potencial biotecnológico

Abstract

La superfamilia de enzimas glucosa-metanol-colina (GMC) se compone de proteínas que unen FAD y poseen un plegamiento común dividido en dos dominios. Algunas oxidorreductasas fúngicas que pertenecen a ella son enzimas auxiliares en la degradación de la lignocelulosa. La mayoría producen el H2O2 requerido por peroxidasas para actuar sobre la lignina o para desencadenar reacciones de Fenton, que producen especies radicales que atacan a la lignocelulosa. El estudio de los genomas de 10 hongos poliporales, únicos organismos capaces de mineralizar totalmente la lignina, desveló la participación de 5 familias GMC en la descomposición de la lignocelulosa. Estas son glucosa oxidasas (GOX), celobiosa deshidrogenasas (CDH), piranosa 2-oxidasas (P2O), metanol oxidasas (MOX) y aril-alcohol oxidasas (AAO). Estudios filogenéticos sugieren que su diversificación ocurrió en una etapa temprana de la evolución fúngica, caracterizada por el escaso número de genes GMC. AAO y MOX son las GMC más abundantes en los 10 genomas, aunque sus números varían entre genomas según la ecofisiología de cada hongo. Así, las oxidorreductasas GMC coevolucionaron junto con las peroxidasas de alto potencial redox durante la especiación de los hongos. La AAO del basidiomiceto Pleurotus eryngii se seleccionó como representante de la superfamilia para estudiar su mecanismo. Esta cataliza la oxidación de alcoholes aromáticos produciendo los correspondientes aldehídos y la reducción de O2 a H2O2 en dos semirreacciones. La de reducción consiste en las abstracciones de un hidruro del carbono ¿ del alcohol por el FAD y la del protón del grupo hidroxilo por la His502 catalítica. Durante la semirreacción de oxidación estas partículas son transferidas al O2 reduciéndolo. La función del residuo Phe397 en la catálisis de la AAO se estudió mediante la comparación de las cinéticas de estado estacionario y transitorio y estudios de afinidad entre la enzima salvaje y variantes mutadas. Los resultados sugieren que la Phe397 ayuda al producto a abandonar el bosillo catalítico. La dependencia de la temperatura de la catálisis de AAO se estudió con el objetivo de dilucidar la participación del efecto mecano-cuántico conocido como tunneling de hidrógeno en la transferencia del hidruro durante la reducción de la enzima. Los datos obtenidos con sustratos protiados y deuterados indican que el efecto túnel está involucrado en la transferencia. La comparación de los datos de la AAO salvaje con los de mutantes del residuo Tyr92, así como estudios cristalográficos, sugieren que la transferencia depende de movimientos proteicos que permiten transferir la partícula desde una configuración organizada antes de la catálisis. Los mecanismos que subyacen a la reoxidación de la enzima y la producción de H2O2 se estudiaron mediante cinéticas rápidas empleando efectos isotópicos de sustrato y solvente. Tras la transferencia inicial de un electrón, la enzima transfiere al O2 un átomo de hidrógeno desde el FAD y un protón desde un lugar de intercambio con solvente en dos procesos químicos independientes. Asimismo, se evaluó la aplicabilidad biotecnológica de oxidasas GMC para la producción de ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA), un precursor de bioplásticos. La AAO oxida precursores del FDCA derivados de la deshidratación de la fructosa de la biomasa vegetal, entre ellos 5-hidroximetilfurfural (HMF) y sus derivados parcialmente oxidados. A pesar de su actividad, la AAO no produce FDCA por su incapacidad de catalizar ciertas reacciones. La acción sinérgica de una peroxigenasa inespecífica (UPO) del hongo Agrocybe aegerita, capaz de catalizar la producción de FDCA a expensas del H2O2 generado por AAO, permitió producir FDCA. Así, se alcanzaron altas tasas de conversión en FDCA con el consumo neto de O2 atmosférico.