Estudio del papel de TLR4 en la transformación hemorrágica e infiltración aguda tras ictus experimental

Resumen

En los países occidentales, el ictus es la segunda causa de muerte, la segunda causa de demencia, y la principal causa de discapacidad entre los adultos. Actualmente, las únicas aproximaciones terapéuticas consisten en la recanalización de las arterias obstruidas mediante el tratamiento fibrinolítico a través del activador del plasminógeno tisular (t-PA) (sólo útil entre el 5-10% de los pacientes), o la trombectomía endovascular. Estos tratamientos son utilizados en condiciones muy restrictivas para evitar el fenómeno de transformación hemorrágica (TH), principal complicación de la trombolísis. Haciéndose necesario el desarrollo de nuevas estrategias neuroprotectoras. Los resultados obtenidos muestran que el receptor TLR4 está implicado en el daño en un modelo experimental tromboembólico in situ, ya que los animales TLR4+/+ presentaron un volumen de infarto superior a los TLR4-/-. Además, demostramos la participación de TLR4 en el proceso de TH tras reperfusión tardía, puesto que observamos una mayor gravedad de la hemorragia y del área de sangrado en los animales TLR4+/+. Al estudiar la integridad de la BHE de estos grupos experimentales de reperfusión tardía observamos que los animales TLR4+/+ presentan un mayor daño. Finalmente, estudiamos los niveles de MMP-9 mediante inmunofluorescencia. La densitometría mostró una reducción de la expresión de esta proteasa en animales TLR4-/- 3 horas tras administrar el fibrinolítico, comparado con el grupo de animales TLR4+/+. Por otro lado, se demuestra que TLR4 ejerce un papel en la modulación mieloide tras ictus, principalmente en la población de neutrófilos. En los animales KOs, con menor volumen de infarto, observamos una disminución en el número de neutrófilos en sangre, 2 días tras la isquemia, y un aumento de neutrófilos infiltrados en el área infartada. Además demostramos que este receptor afecta a la población de microglía, más reducida en animalesKOs, 2 días tras isquemia. A pesar de que la infiltración de neutrófilos en el cerebro isquémico ha sido reconocida como un importante factor patogénico, en animales TLR4-/-, la eliminación de los neutrófilos no logró inducir la neuroprotección sugiriendo que, en ausencia de TLR4, los neutrófilos no juegan un papel deletéreo y, que el efecto neuroprotector que encontramos es, al menos en parte, dependiente de los neutrófilos. Comprobamos que los neutrófilos de los animales KOs tras isquemia presentaban un fenotipo-N2 o alternativo, tanto en el parénquima cerebral, como en la sangre. Además, el proceso de infiltración de neutrófilos y su papel diferencial se debe al TLR4 del propio neutrófilo ya que en los ratones carentes de TLR4 en plaquetas no había reducción del tamaño de la lesión y en los animales carentes de TLR4 en células mieloides se producía una disminución muy marcada. Este resultado correlaciona con un aumento de porcentaje de neutrófilos-N2 que también encontramos en el parénquima cerebral. Por último, el análisis de expresión génica diferencial en neutrófilos aislados de ambos tipos de ratón, tras 48 horas de la isquemia mostro que los neutrófilos-N2 de la sangre de animales que carecen del receptor TLR4, presentan altos niveles de expresión de genes que codifican para proteínas inhibidoras de proteasas y para fosfatasas que intervienen en la regulación de MAP quinasas, cuya ruta juega un papel crucial en la señalización inflamatoria. En resumen, nuestros datos muestran la implicación del receptor TLR4 sobre la modulación mieloide tras ictus y demuestran por primera vez la existencia de neutrófilos alternativos-N2 en la isquemia cerebral experimental dependiente de la ausencia de este receptor. La heterogeneidad de las poblaciones de neutrófilos y la capacidad de la ausencia/inhibición de TLR4 de promover una entrada selectiva de estas células al tejido isquémico es un proceso novedoso para la modulación de la inflamación aguda que abre nuevas esperanzas para el tratamiento de esta patología.