Nuevos alérgenos de Anisakis simplexestudios in silico e in vitro

Resumen

Anisakis simplex es un nematodo parásito cuyas larvas de tercer estadio pueden encontrarse en productos de la pesca de captura marina y ocasionar síntomas alérgicos tras ingerirlas vivas en pescados crudos o poco cocinados que no hayan sido congelados. Estos síntomas alérgicos pueden ser locales o generalizados según la respuesta inmunitaria del hospedador, distinguiéndose tres fenotipos clínicos, anisakiosis gástrica, AG, anisakiosis gastroalérgica, AGA, y urticaria crónica asociada a sensibilización por Anisakis, UC+. Los pacientes que han sufrido un episodio de AGA suelen presentar pruebas cutáneas positivas y tener IgE específica frente a Anisakis sin embargo, pueden existir falsos negativos. Además las pruebas cutáneas y la IgE específica frente al extracto de Anisakis, en cierta medida, son falsamente positivas en sujetos sanos. Por otro lado, la urticaria crónica es una patología sin una causa definida aunque se conoce su mecanismo efector, la degranulación de los mastocitos. Ante esta situación buscamos mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico serológico de la anisakiosis mediante el descubrimiento de nuevos alergenos y el estudio de las reacciones cruzadas con otros organismos e intentamos descubrir nuevas posibles causas de urticaria crónica a través del estudio serológico de pacientes sensibilizados y no sensibilizados a A. simplex. Además, nos propusimos identificar las diferencias de estructura primaria y secundaria entre las tropomiosinas de invertebrados, que son alergénicas, y vertebrados, que no son alergénicas, así como sus diferencias en digestibilidad y modificaciones postraduccionales para intentar comprender mejor las causas de su alergenicidad. En este trabajo la hemoglobina de Anisakis ha sido caracterizada como un nuevo alergeno principal del parásito siendo incluido en la base de datos oficial con el nombre de Ani s 13. Se presenta en forma de tetrámeros y octámeros, siendo estos últimos más ricos en grupo hemo. No presenta reactividad cruzada con la hemoglobina de Ascaris, que es un nematodo parásito muy próximo filogenéticamente, y nuestros análisis bioinformáticos de epitopos predijeron la existencia de un epitopo único en su superficie. Además la miofilina y la arginina quinasa de Anisakis fueron secuenciadas, clonadas y purificadas por primera vez, sin embargo los pacientes estudiados no las reconocieron, por lo que no han podido ser consideradas alergénicas en nuestras condiciones experimentales. Por otro lado, se observó que una sensibilización previa a tropomiosina de langostino podría generar un reconocimiento cruzado de la de Anisakis, contribuyendo a la aparición de falsos positivos diagnosticados mediante ImmunoCAP. Los pacientes con urticaria crónica presentaron niveles superiores de IgE frente a todos los extractos de nuestro estudio comparado con los que no tenían urticaria crónica, habiéndose reducido la alergenicidad en los extractos sometidos a cocción, pero no viéndose afectado el reconocimiento de la IgA e IgG. Los pacientes con UC+ que presentaron un empeoramiento de la urticaria tras ingerir pescado azul, tenían unos niveles más bajos de diamino oxidasa sérica y éstos se relacionaban de forma directa con la producción de IgE específica frente a Anisakis. Con respecto a las tropomiosinas, descubrimos que las de invertebrados presentan regiones con una menor probabilidad de plegamiento en hélice alfa que las de vertebrados y son candidatas a ser las responsables de su alergenicidad. También, tomando como modelo la tropomiosina de Anisakis establecimos una metodología de análisis bioinformático de superficies moleculares para el desarrollo de nuevas herramientas orientadas a la predicción de reacciones cruzadas. Finalmente, se demostró que la tropomiosina de pescados, podría ser alergénica en pacientes que presentan reacciones adversas recurrentes tras la ingesta de pescado.