Caracterización de las actividades de RepB y su implicación en el proceso replicativo del plásmido promiscuo pMV 158

Resumen

El plásmido pMV158 es el prototipo de una amplia familia de plásmidos que emplean el mecanismo de replicación por círculo rodante (RCR) para duplicar su DNA. pMV158 es un plásmido movilizable, que determina resistencia a tetraciclina y exhibe una enorme promiscuidad, como queda demostrado por su capacidad para colonizar una gran variedad de especies bacterianas de diversos filos. Esta promiscuidad debe estar estrechamente relacionada con las características de la proteína iniciadora de la replicación, RepB, codificada por el propio plásmido, la cual presenta una conformación hexamérica singular entre las proteínas iniciadoras de RCR de plásmidos y bacteriófagos. Por todo ello, la presente tesis pretende ahondar en el conocimiento de RepB, así como en el de su papel en el proceso replicativo de pMV158. Con este fin se establecieron los siguientes objetivos: caracterización de la actividad enzimática de RepB, análisis de la interacción de RepB con el origen de replicación de doble cadena de pMV158 (dso), estudio de la posible interacción entre RepB y PcrA de Streptococcus pneumoniae, y elaboración de un modelo para el proceso replicativo de pMV158. RepB es una endonucleasa HUH constituida por dos dominios, el dominio N-terminal (OBD), responsable de la actividad enzimática y de la unión al dsDNA específico del dso, y el dominio C-terminal (OD), implicado en la hexamerización de la proteína. En este trabajo de tesis hemos estudiado su actividad enzimática en el contexto de la replicación de pMV158. Además de la tirosina Y99, que hasta ahora se consideraba el único residuo catalítico, hemos identificado otros aminoácidos implicados en la catálisis sobre el ssDNA, entre los que destaca H102 como un posible segundo residuo catalítico. La formación de un aducto covalente entre RepB y el extremo 5¿ del DNA generado por la actividad endonucleasa de la proteína durante la etapa de la iniciación es esencial para el mecanismo replicativo del plásmido. Aunque este aducto se consideraba de naturaleza lábil, ya que no se había logrado su detección, finalmente hemos sido capaces de identificarlo y analizar su estabilidad bajo distintas condiciones. Otra de las contribuciones destacables de este trabajo ha sido desvelar la importancia del catión del centro activo tanto en la actividad catalítica como en la termoestabilización de la estructura de RepB. Para dilucidar los primeros pasos de la replicación de pMV158 hemos caracterizado las interacciones que se establecen entre RepB y los distintos elementos del dso. Dichas interacciones no se limitan a conectar enzima y sustrato, sino que parecen fundamentales para el ensamblaje de un replisoma funcional. En el mecanismo RCR la actividad helicasa sobre el dsDNA plasmídico es necesaria para desplazar la cadena parental que sufrió la rotura endonucleolítica inicial mediada por Rep, por lo que el replisoma de pMV158 debe incluir una proteína que desempeñe dicha función helicasa. La helicasa bacteriana PcrA, que interviene en la replicación de otros plásmidos RCR prototípicos de Firmicutes, como pT181 o pC221, podría formar parte del replisoma de pMV158 y ayudar al avance de la horquilla replicativa. Alternativamente, y teniendo en cuenta la singular conformación de RepB, cabría la posibilidad de que la replicación de pMV158 fuera independiente de la presencia de PcrA y que la separación de las dos cadenas parentales del DNA plasmídico se efectuara, con la contribución de la actividad motora de la DNA polimerasa, gracias al enhebrado del hexámero de RepB en una de ellas. Por último se ha establecido un modelo para la replicación de pMV158 en el que se han integrado resultados de este trabajo y de otros anteriores.