Avances en el estudio de las enzimas implicadas en la ruta de degradación del anillo esteroideo de "Rhodococcus ruber Chol-4"

Resumen

Rhodococcus ruber Chol-4 es una actinobacteria aislada a partir de lodos obtenidos en una Estación Depuradora de Aguas Residuales (Ciudad Real, España). Esta cepa es capaz de crecer en medio mínimo suplementado con esteroides y compuestos aromáticos, mostrando una gran capacidad catabólica y por tanto potencial biotecnológico. La actividad de la enzima 3-cetosteroide-delta-1-deshidrogenasa (KstD) en combinación con la 3-cetosteroide-9-alfa-hidroxilasa (KshAB) es clave en el esquema general del catabolismo bacteriano de esteroides, ambas son responsables de la rotura del núcleo esteroide. KshAB inicia la apertura del anillo esteroideo mediante la 9-alfa hidroxilación del carbono C9 de 4-eno-3-oxosteroides o 1,4-dieno-3-oxosteroides, transformándolos en 9¿alfa-hidroxi derivados. Por otra parte, la actividad KstD convierte 4-eno-3-oxoesteroides o 9-hidroxi-4-eno-3-oxoesteroides a 1,4-dieno derivados. El objetivo de este trabajo es la caracterización funcional de las enzimas catabólicas de degradación del anillo esteroideo A y B en Rhodococcus ruber Chol-4 para el posterior desarrollo de aplicaciones biotecnológicas. En primer lugar, se analizó y anotó el genoma de Chol- 4. El análisis del genoma permitió detectar la presencia redundante de genes catabólicos, identificar siete de los ocho clusters de las vías centrales de degradación de compuestos aromáticos descritas anteriormente en R. jostii RHA1 e identificar varias vías catabólicas periféricas de compuestos aromáticos. Todo ello evidencia el alto potencial de biodegradación/biotransformación de Chol-4. Nuestro análisis del genoma proporciona una valiosa guía para futuros estudios moleculares o fisiológicos para la microbiología de R. ruber y proporciona una base para una mejor explotación biotecnológica de esta cepa. No obstante, la redundancia de enzimas relacionadas con la degradación de esteroides supone una seria dificultad en la implementación de ingeniería metabólica para la obtención de intermediarios de interés industrial en esta cepa. Estudios previos a esta Tesis Doctoral permitieron la identificación funcional de al menos tres kstDs (kstD1, kstD2 y kstD3) en la cepa de R. ruber Chol-4. Los resultados de esta Tesis Doctoral muestran que el perfil cinético frente a varios sustratos de KstD1 y KstD2 fue muy similar in vitro mientras que su funcionalidad in vivo para cada una es diferente: KstD2 es esencial para el crecimiento en testosterona, ácido cólico y AD; KstD1 no tiene una funcionalidad definida en esta cepa, aunque su expresión se indujo al crecer en AD; KstD3 mostró una mayor preferencia por los sustratos de esteroides saturados y está involucrada en el crecimiento de colesterol y fitoesteroles. En esta tesis doctoral se han caracterizado también tres genes homólogos de kshA y un gen kshB en diferentes regiones genómicas de R. ruber Chol 4. Se han realizado un conjunto de experimentos con el fin de comprender sus funciones específicas: i) descripción de las enzimas KshAB ii) construcción y caracterización de mutantes AkshB y AkshA simples, dobles y triples en R. ruber iii) estudios de crecimiento de las cepas mutantes en diferentes sustratos y iv) ensayos de complementación genética y biotransformación de los mutantes. Nuestros resultados mostraron que la isoforma KshA2 es necesaria para la degradación de los sustratos esteroides con cadena lateral corta, mientras que KshA3 trabaja en las moléculas con cadenas laterales más largas. KshA1 es una enzima más versátil relacionada con el catabolismo ácido cólico, aunque también colabora con actividades KshA2 o KshA3 en el catabolismo de esteroides. Por último, en el presente trabajo de Doctorado también se han probado algunas aplicaciones biotecnológicas. Concretamente, intensificando la actividad KstD en una cepa de Rhodococcus para obtener una cepa con la función de deshidrogenación mejorada.