Caracterización de proteína-fosfatasas de tipo 1 de Leishmania infantum y estudio mediante RNA-Seq de las alteraciones en la expresión génica diferencial inducidas en líneas Knock-in

Resumen

La leishmaniasis visceral es una zoonosis causada por el parásito Leishmania infantum en la cuenca mediterránea. Las proteínas fosfatasas tipo 1 (PP1) son las principales serina-treonina fosfatasas presentes en los organismos eucariotas y participan en la regulación de diversos procesos celulares. El papel de dichas proteínas apenas ha sido estudiado en el género Leishmania. De acuerdo a los análisis de expresión génica diferencial llevados a cabo mediante microarrays de ADN (Alcolea y cols. 2010), la PP1 LinJ.15.0240 (PP1-240) y ciertas PP1 codificadas por el cromosoma 34 (cluster PP1-34) están diferencialmente expresada a lo largo del ciclo biológico de L. infantum. Aún habiéndose puesto de manifiesto en diversos estudios la importancia del estado de fosforilación proteico durante los procesos de diferenciación del parásito, la funcionalidad concreta de las PP1 en Leishmania spp es desconocida, al igual que las vías de señalización intracelular en general. El objetivo fundamental de esta tesis doctoral es la caracterización de la PP1 codificada por el gen LinJ.15.0240 (PP1-240) y del cluster de PP1 localizado en el cromosoma 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840, LinJ.34.0850) de L. infantum (cluster PP1-34). Dicha caracterización incluye el estudio de la estructura primaria, el análisis de la expresión génica en los diferentes estadíos el ciclo biológico del parásito, el estudio de la localización subcelular y el estudio de las alteraciones en la expresión génica diferencial global en líneas de promastigotes axénicos knock in, es decir, transfectantes estables que sobre-expresan de forma constitutiva PP1-240 o el cluster PP1C-34. En síntesis, los estudios llevados a cabo en esta tesis doctoral han revelado: i) alto grado de conservación de las secuencias de las proteínas-fosfatasas PP1-240 y del cluster PP1-34 de L. infantum; ii) predominio de la sub-expresión en los perfiles de expresión génica diferencial detectados en líneas knock-in de sobre-expresión de las PP1 en estudio; iii) influencia de las PP1 en procesos celulares relacionados con la transcripción, traducción, modificación post-traduccional de proteínas, el ciclo celular, el transporte y las moléculas de superficie; iii) una posible implicación de la proteína PP1-240 en procesos de diferenciación celular como sugieren la sub-expresión de los marcadores de metaciclogénesis SHERP y meta 1 en la línea de sub-expresión pIR-PP1-240; iv) la inducción de estrés celular en las líneas de sobre-expresión de las proteína-fosfatasas en estudio por la detección de los genes A2 y peroxidasa; v) la vinculación de las proteínas codificadas por el cluster PP1-34 con procesos relacionados con el citoesqueleto y flagelo. Por tanto, estos resultados representan un avance en el conocimiento sobre la funcionalidad de las PP1 en L. infantum. Además, teniendo en cuenta los avances científicos realizados en los últimos años (Peti y Page, 2015), las PP1 y los posibles sustratos de interacción identificados podrían representar potenciales dianas de acción en el área de la terapéutica clínica frente a la leishmaniasis. Futuros ensayos basados en el estudio del interactoma de las PP1 en L. infantum podrían contribuir a la identificación de tales dianas farmacológicas para el tratamiento de la leismaniasis.