Búsqueda de nuevos factores pronósticos y de terapias combinadas en el tratamiento de neoplasias mieloproliferativas

Resumen

La mielofibrosis (MF) es una neoplasia mieloproliferativa crónica (NMPc) caracterizada por una proliferación clonal de la célula madre mieloide patológica y por diferentes grados de fibrosis de la médula ósea. La mutación más frecuente en MF es JAK2V617F que se encuentra en aproximadamente el 50-60 por ciento de los pacientes con MF. Las mutaciones de CALR se encuentran en un 35-50 por ciento de los pacientes. La diversidad clínica y de respuesta al tratamiento de estos pacientes no puede ser explicada con las mutaciones en JAK2, CALR y MPL. Por lo que resulta necesario el estudio de nuevas mutaciones. Hasta la fecha, el único tratamiento específico aprobado para el tratamiento de la MF es el ruxolitinib, un inhibidor específico de JAK2. Ha demostrado ser un tratamiento eficaz, pero la búsqueda de tratamientos combinados con ruxolitinib responde a la necesidad de conseguir un aumento de la eficacia del tratamiento y disminución de su toxicidad. Por ello, decidimos estudiar el perfil mutacional de los pacientes de MF mediante secuenciación masiva y buscar un tratamiento combinado con ruxolitinib para el tratamiento de esta enfermedad. Se ha estudiado el patrón mutacional de 27 pacientes de MF mediante secuenciación masiva y con un panel de genes relacionados con la patología mieloide. El gen con mayor frecuencia de mutación fue JAK2 seguido de TET2, ASXL1, PRPF40B, EZH2 y CALR. Una mayor carga mutacional de JAK2 está asociado con el diagnóstico de PV-MF y una de CALR lo está con TE-MF. La mutación en al menos uno de los genes relacionado con la regulación epigenética (TET2, ASXL1, EZH2 e IDH1/2) se encuentra fuertemente asociado con el diagnóstico de la MFP y presenta una tendencia en tener duraciones de respuesta a ruxolitinib inferiores al grupo sin mutación en estos genes. Se han establecido tres modelos ex vivo para el estudio de sensibilidad a fármacos y de sinergia de combinaciones en MF. Se determinó el mejor modelo para el estudio de la sensibilidad a ruxolitinib mediante una correlación de los datos de las curvas dosis respuesta realizadas ex vivo con los datos clínicos de pacientes tratados con ruxolitinib, que correspondió con el modelo directo porque es el que mejor discrimina los respondedores y los respondedores de larga duración a la vez que es el que menos manipulación requiere de la muestra y el que más rápidamente se obtienen los resultados. El modelo de elección para el cribado de fármacos en la búsqueda de combinaciones con ruxolitinib fue el modelo de amplificación de células mieloides, porque, además de discriminar a los respondedores de larga duración, proporcionaba el número suficiente de células para hacer el cribado. Para la búsqueda de la mejor combinación con ruxolitinib se realizó un cribado de 28 fármacos empleando el modelo de amplificación y monitorización de las células mieloides CD13 positivas por citometría de flujo. La combinación elegida, ruxolitinib/nilotinib/prednisolona se validó haciendo un análisis de la sinergia empleando análisis de viabilidad celular con WST-8 y análisis bioinformático calculando el índice de combinación CI. Presentó un comportamiento sinérgico tanto en líneas celulares como en muestras de pacientes de MF. Se estudió las vías de señalización afectadas por un array de fosfoproteínas y posterior validación por western blot y se vio que las vías de señalización que principalmente se vieron afectadas fueron Akt/PI3K/mTOR, JAK/STAT y las quinasas de la familia SRC. Los mecanismos compensatorios y de activación de las vías de señalización de Akt, JAK/STAT, ERK o SRC de los fármacos en monoterapia se vieron anulados en la combinación. Por último, se estudió el impacto sobre la expresión de colágeno en la línea derivada de células mesenquimales de médula ósea HS27a mediante qPCR e inmunocitoquímica. Se vio que el nilotinib es eficaz a la hora de inhibir la síntesis de colágeno I tanto en monoterapia como en la combinación ruxolitinib / nilotinib.