Aproximación a un sistema de vigilancia molecular de leishmania infantum y sus vectores

Resumen

Durante la última década se ha demostrado un incremento de la prevalencia de leishmaniasis en países endémicos, así como la aparición de nuevos focos hacia el norte del continente europeo. Esta reemergencia de la leishmaniasis asociada a diversos factores de riesgo, consecuencia de cambios ambientales y un incremento en las condiciones de inmunosupresión. En este escenario destaca el brote de leishmaniasis de la Comunidad Autónoma de Madrid, CAM. Desde julio de 2009 hasta mayo de 2015 causó 644 casos, incrementando la TI de la enfermedad de 2,44 casos en 100.000 habitantes en 2009 a 18,91 en 2015. Este brote, sin precedentes, fue consecuencia de un ciclo de transmisión silvestre que entró en contacto con la población. La nueva dinámica de la leishmaniasis pone de manifiesto la necesidad de establecer medidas de vigilancia que permitan seguir las poblaciones de parásito y vector y ayudar a establecer las medidas de control adecuadas. En este contexto las herramientas de moleculares por su elevada capacidad de discriminación, resultan de gran utilidad. Nos planteamos como objetivo la validación de una serie de herramientas de tipado molecular que aportasen al conocimiento de la epidemiología de la leishmaniasis. En el primer estudio se analizaron las regiones microsatélites comprendidas en las regiones ITS1 e ITS2 de 73 cepas de L. infantum aisladas en la CAM 2008 y 2012, la mayoría de los aislados del brote compartían el mismo genotipo, identificado también en el reservorio silvestre implicado en la transmisión a humanos durante el brote. Este genotipo, ITS LOMBARDI, había pasado inadvertido en previos estudios llevados a cabo en la cuenca de mediterránea. La sospecha de que pudiera tratarse de un genotipo nuevo nos llevó a analizar un segundo conjunto de 83 cepas de L. infantum aisladas entre 1988 y 2005, comprobándose que el genotipo ITS LOMBARDI se encontraba circulando en distintas regiones de la CAM, desde 1992. Tras estos hallazgos se estudió la figura a nivel nacional, analizando 550 cepas de L. infantum, diversas a nivel de zimodema y origen geográfico, obtenida de diferentes hospedadores entre 1986 y 2015. El análisis confirmó que este genotipo estaba ampliamente distribuido en otras regiones del país, desde hace 30 años y se identificó una nueva variante llamada ITSLISA. En una tercera aproximación mediante MultiLocus Sequence Analysis, investigamos la estructura de poblaciones de L. infantum en Eurasia, incluyendo aislados del brote de la CAM, y de diversos países de África. Validamos siete marcadores moleculares en 385 cepas, y demostramos la existencia de tres grandes poblaciones de L. infantum circulando en España, incluyéndose en dos de estas, todos lo aislados del brote CAM. En el cuarto estudio se validó un protocolo de PCRRFLP, que utiliza los genes cytb nd1 del flebótomo, para la identificación de especies de flebótomos de la cuenca mediterránea. Estudiamos 155 flebótomos de cuatro especies, incluyendo los vectores de L. infantum, Phlebotomus perniciosus y P. ariasi, capturados en distintas regiones de España. Este conjunto se completó con secuencias de ADN del Genbank con especies presentes en la cuenca mediterránea y Oriente Medio. Nuestros resultados revelaron que este método no puede discriminar específicamente a todas las especies estudiadas. Por ello, en un quinto estudio, aplicamos la metodología de DNA barcoding, utilizando los genes cytb y coi. Esta metodología permitió distinguir las especies de flebótomos de manera inequívoca, mostrando una concordancia del 100 por ciento con la taxonomía morfológica. El análisis filogenético de los genes cytb y coi permitió discriminar subpoblaciones en función del origen geográfico. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral pueden contribuir a mejorar la comprensión espacio temporal de los distintos genotipos de L. infantum y sus vectores, estableciendo las bases para un sistema de vigilancia molecular de la leishmaniasis en España.