Primoconolización por Pseudomonas aeruginosa en la colonización patogénica broncopulmonar en fibrosis quísticadiagnóstico por técnicas de microbiología molecular, estudio de clonalidad y crecimiento en biofilm

Zusammenfassung

Existe una adaptación evolutiva durante el proceso de colonización pulmonar crónica por Pseudomonas aeruginosa en los pacientes con fibrosis quística, FQ. Este proceso justificaría las diferencias entre los aislados no mucosos, con alta sensibilidad a los antibióticos y normomutadores que causan la primocolonización frente a las cepas mucosas, resistentes a los antibióticos e hipermutadoras que se aíslan con mayor frecuencia durante la colonización crónica, tanto en crecimiento planctónico como en biopelículas. Se plantearon 7 objetivos fundamentales en esta tesis doctoral. 1. Determinar la prevalencia de P. aeruginosa, su patrón de colonización en los pacientes atendidos en la Unidad de FQ del Hospital Universitario Ramón y Cajal entre los años 1993 y 2011 2. Describir las características epidemiológicas y clínicas de los pacientes con FQ con primocolonización broncopulmonar por P. aeruginosa 3. Establecer la capacidad de crecimiento en biopelículas de cepas de P. aeruginosa de primocolonización, comparando la sensibilidad antibiótica en biopelículas con su crecimiento planctónico y la posible presencia de cepas hipermutadoras 4. Desarrollar un método para analizar la capacidad de prevención de diferentes antimicrobianos de la formación de biopelículas y definición de un nuevo parámetro BPC, concentración que previene la formación de biopelículas 5. Conocer la estructura poblacional de los aislados de primocolonización y analizar su relación genética mediante las técnicas de PFGE, MLST y repPCR Diversilab 6. Adaptar la espectrometría de masas MALDITOF para el análisis de la clonalidad y de la evolución de los aislados P. aeruginosa 7. Evaluar técnicas de microbiología molecular para mejorar la detección de P. aeruginosa en muestras respiratorias. Los resultados se han estructurado en tres bloques. A. Epidemiología de la colonización broncopulmonar entre 1993 y 2011. Se ha evidenciado que la distribución de las especies bacterianas fue similar en todos los periodos de estudio, detectándose una disminución progresiva de la prevalencia de P. aeruginosa con un retraso en el último periodo la edad de primocolonización. B. Estudio de la primocolonización por P. aeruginosa. Se han caracterizado las cepas de 25 pacientes en los que detectamos el evento de primocolonización, recogiendo las variables clínicas asociada. Se asoció significativamente un retraso en la primocolonización en los pacientes con mayor índice de masa corporal y una colonización previa por Staphylococcus aureus. Los aislados de primocolonización presentaron baja tasa de resistencia a los antimicrobianos habitualmente empleados en el tratamiento erradicador, especialmente en condiciones de crecimiento planctónico. Con inóculos de biopelícula, las tasas de resistencia fueron mayores, siendo necesarias altas concentraciones de antimicrobianos para prevenir e inhibir la formación de la biopelícula. La hipermutación no es un mecanismo relevante en las cepas de primocolonización aunque una cuarta parte de las cepas eran débilmente mutadoras. La alta diversidad genética detectada en nuestras cepas de primocolonización demuestra eventos de adquisición independiente con escasa transmisión entre pacientes, sin la presencia de ningún clon epidémico internacional. Existe una gran concordancia en los resultados obtenidos mediante las cuatro técnicas de epidemiología molecular empleadas. C. Detección precoz de P. aeruginosa mediante técnicas de microbiología molecular. Se ha evaluado la amplificación por PCR de genes específicos de P. aeruginosa, oprL y mucA en muestras respiratorias para mejorar la detección de este microorganismo. Este es un método rápido y sensible, en el que se pueden alcanzar un Valor Predictivo Positivo óptimo. Debido a la importancia de una detección precoz de P. aeruginosa, esta técnica podría implementarse como método molecular rápido de cribado en las fases de primocolonización.