Desarrollo de ensayos in vitro para la identificación de nuevas moléculas con actividad antimalárica y bloqueantes de la transmisión de la enfermedad

Résumé

La malaria constituye un grave problema de salud a nivel global, afectando a más de 200 millones de personas y provocando más de 400.000 muertes cada año. Esta enfermedad tiene la mayor tasa de mortalidad en el África subsahariana, donde se concentra la mayor incidencia de casos producidos por Plasmodium falciparum. Durante la última década se han desarrollado e implementado diversas estrategias tanto a nivel de control del vector (la hembra del mosquito Anopheles) como de quimioterapia para el hospedador humano. Una de estas estrategias se ha centrado en el descubrimiento y desarrollo de nuevos medicamentos que permitan una interrupción de la transmisión del parásito desde el hospedador al mosquito. En este trabajo de Tesis se describe la adaptación y el desarrollo de un ensayo in vitro que no solo permite la identificación de moléculas que inhiben la funcionalidad de los gametocitos V de P. falciparum, sino que además lo hace en un formato de alto rendimiento. Utilizando como marcador específico del gameto femenino la proteína de superficie Pfs25 es posible identificar compuestos que impidan la transformación de los gametocitos femeninos a gametos, un proceso que ocurre de forma natural en el interior del mosquito. La adaptación del ensayo de activación del gametocito femenino (PfFGAA) a formato de alta densidad fue posible gracias a los esfuerzos combinados de escalado de la producción de gametocitos, así como a la tecnología de imagen de alta resolución. Una vez conseguida la puesta a punto de los parámetros óptimos, se llevó a cabo la evaluación de un set de 50 antimaláricos comerciales que validó el ensayo y puso de manifiesto la falta de fármacos activos frente a los estadios transmisibles del parásito. Para el cribado de alto rendimiento con el PfFGAA, la colección elegida fue el Tres Cantos Antimalarial Set (TCAMS), constituida por 13.533 moléculas con actividad frente a las formas asexuales eritrocíticas de P. falciparum. La elección de esta colección se basó en la idea de encontrar moléculas con actividad dual, es decir, frente a los estadios asexuales eritrocíticos (responsables de la sintomatología clínica) así como frente a los gametocitos en estadio V (responsables de la transmisión). El cribado del TCAMS permitió la identificación de 405 moléculas inhibidoras de la formación del gameto femenino, entre las cuales se encontró una amplia diversidad de perfiles tanto químicos como biológicos, posteriormente estudiados en mayor detalle. Por otro lado, y con el objetivo de confirmar el potencial de nuestras moléculas como bloqueantes de la transmisión en el mosquito, así como la correlación con los datos in vitro, se evaluó la actividad de seis moléculas en el ensayo de referencia Standard Membrane Feeding Assay (SMFA). Adicionalmente, dos de estas moléculas ensayadas en el mosquito se estudiaron en el modelo de ratón de P. berghei, lo cual permitió evaluar la actividad in vivo de estos productos frente a las formas asexuales eritrocíticas. Finalmente, una serie de estudios farmacocinéticos y de ADME revelaron datos sobre la disponibilidad de estas dos moléculas en sangre. En conclusión, esta Tesis ha permitido el desarrollo de un nuevo ensayo in vitro para cribado de alto rendimiento, así como el descubrimiento de cientos de nuevas moléculas con potencial para bloquear la transmisión del parásito. Por tanto, estos resultados suponen un importante avance no solo para el desarrollo de nuevos fármacos antimaláricos, sino también para incrementar el conocimiento sobre la biología del parásito implicada en su transmisión, que adicionalmente podría ser de utilidad en otras de las estrategias que persiguen la erradicación final de la malaria.