Estudio cristalográfico de proteínas implicadas en la ruta de los inositoles polifosfatados y su relación con el ARN

Resumen

Los inositoles polifosfatados (IPs) son moléculas pequeñas y solubles que participan en señalización celular y procesos metabólicos. Las inositol polifosfato quinasas (IPKs) son enzimas que regulan los niveles de estos IPs. En la última década, se ha puesto de manifiesto los IPs y las IPKs están directa o indirectamente relacionados con la biogénesis y metabolismo del ARN. En este trabajo se han estudiado mediante Cristalografía de rayos X varias familias de proteínas; por un lado, tres familias diferentes de IPKs en mamíferos (inositol 1,4,5-trisfosfato 3-quinasa (IP3 3-K), inositol 1,3,4,5,6-pentaquisfosfato 2-quinasa (IP5 2-K) e inositol 1,2,3,4,5,6-hexaquisfosfato 6-quinasa (IP6K) y por otro lado una proteína implicada en el reconocimiento de ARN en levaduras (Nrd1). Cada IPK presenta sus funciones particulares. Así, la enzima IP3 3-K cataliza la síntesis de inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (IP4) a partir del IP3 y ATP y es fundamental para el metabolismo de calcio. Esta se encuentra regulada por la calmodulina (CaM). Hemos resuelto la estructura del complejo Ca2+/CaM y el dominio de unión a CaM de IP3 3-K A de humano identificándose un nuevo motivo de unión a CaM y los residuos involucrados en la formación del complejo. Por otro lado, la enzima IP5 2-K fosforila el IP5 para producir el inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisfosfato (IP6). En mamíferos, la IP5 2-K es crítica para el desarrollo embrionario y juega un papel importante en la biogénesis del ARNr. Se ha resuelto la estructura de IP5 2-K de Mus musculus la cual ha revelado las características distintivas del reconocimiento del inositol y de la catálisis en mamíferos, un nuevo sitio de unión de zinc, y un parche básico en la superficie que podría ser el clave en las funciones de IP5 2-K en la biogénesis del ARN. Finalmente, la IP6K actúa sobre el IP6 y lo fosforila en la posición 5 produciendo algunos isómeros de inositol pirofosfatado (IPP), los cuales participan también en múltiples eventos celulares. En este trabajo se han producido muestras de IP6K de humano plegadas correctamente, diseñado varias estrategias para cristalizar esta enzima y construido un modelo estructural de IP6K que ha permitido la identificación de residuos clave para la actividad enzimática. En cuanto a Nrd1, esta proteína forma parte del complejo NNS, formado por tres proteínas, responsable de la terminación de los transcritos no codificantes de la ARN Polimerasa II. Hemos determinado la estructura del dominio de unión a ARN de Nrd1, la cual consta de un RRM canónico y un dominio denominado ¿Split¿ con arquitectura novedosa. Se ha cristalizado además Nrd1 en complejo con diferentes ARNs que contienen GUAA, su secuencia diana, observando un modo único de unión a ARN en el que los dos dominios de Nrd1 están involucrados. En conclusión, esta tesis supone desde la biología estructural, un gran avance en el campo de los inositoles fosfatados, el análisis de su relación con ARN y el reconocimiento de ARN en proteínas relacionadas.