Quitooligosacáridos bifuncionalesrelación entre características químico-físicas y propiedades biológicas

Resumen

Esta Tesis Doctoral se ha centrado en la obtención de oligosacáridos de quitosano mediante diferentes procesos de obtención y en su caracterización fisicoquímica y funcional. El objetivo principal ha sido la búsqueda de relaciones entre las características fisicoquímicas y las propiedades biológicas que ayuden a esclarecer los mecanismos de acción de los COS. La obtención de COS se llevó a cabo mediante tres procesos diferentes a partir de dos quitosanos. El proceso 1 consistió en una despolimerización enzimática empleando quitosanasa. En el proceso 2 se incorporó una hidrólisis ácida previa a la despolimerización con la misma enzima. En el proceso 3 se reacetilaron los quitosanos de partida antes de la misma hidrólisis. Los COS obtenidos se separaron en función del peso molecular, COS 1, COS 2 y COS 3 correspondientes a los tamaños de corte de peso molecular de 30 10 kDa, 10 5 kDa y menores de 5 kDa. Estos se caracterizaron fisicoquímicamente en términos de grado de acetilación, estructura, patrón de distribución de monómeros acetilados, peso molecular promedio y distribución y composición intramolecular de oligómeros. Para ello se emplearon como técnicas: resonancia magnética nuclear de protón y de carbono, fluorescencia, cromatografía de alta presión de exclusión molecular y espectrometría de masas. La capacidad antibacteriana se determinó mediante el método de concentración mínima inhibitoria frente a dos microorganismos modelo, E. coli y L. monocytogenes. La capacidad antioxidante se evaluó mediante diversos métodos basados en la capacidad de transferencia de electrones y protones, como ABTS, DPPH, FRAP y ORAC. La mucoadhesión se evaluó a través de la interacción con mucina mediante medidas del potencial zeta. La capacidad antiinflamatoria se evaluó en ratones y en macrófagos peritoneales murinos Raw 264.7 mediante citometría de flujo y Western blot. Se obtuvieron 18 fracciones de COS con diferentes características fisicoquímicas a partir de dos quitosanos con similares características de DA, PA, y Mw. Todas presentaron un PA aleatorio y mayor abundancia de extremos reductores ocupados por N glucosaminas respecto a los quitosanos sustrato. Los COS procedentes del proceso 2 mostraron mayor abundancia de este tipo de extremos respecto a COS de los otros procesos. También mostraron presencia de HMF y AGEs como consecuencia de la doble hidrólisis. Los COS procedentes del proceso 3 mostraron además presencia de extremos reductores ocupados por N acetilglucosaminas, y su DA fue superior al DA de los COS del proceso 1 y 2. En relación a la caracterización funcional los COS 1 del proceso 1, con un balance entre oligómeros acetilados de mayor Mw y su equilibrio con las oligómeros completamente desacetilados, fueron capaces de inhibir el crecimiento de E. coli y L. monocytogenes. Los COS con un peso molecular menor de 5 KDa y un porcentaje de residuos completamente desacetilados de 0 hasta 88 por ciento mostraron mayor capacidad de atrapamiento de radicales libres DPPH y ABTS, demostrando la mayor participación de grupos OH en estos mecanismos de donación de electrones. Los COS 3 obtenidos del proceso 2 mostraron mayor capacidad antioxidante ORAC y poder reductor, demostrándose la posible participación de extremos reductores ocupados por N glucosaminas y de AGEs en este otro tipo de mecanismos. Los COS con un peso molecular entre 5 y 18 kDa, y un DA entre 11 y 15 y alto contenido de residuos desacetilados presentaron fuerte mucoadhesión, siendo capaz de neutralizar el potencial zeta negativo de la mucina. Finalmente se demostró que el balance entre secuencias acetiladas y monoacetiladas facultan al COS 2 para inhibir parcialmente la inflamación producida por el LPS. Por el contrario, la predominancia de las secuencias completamente desacetiladas así como la mayor abundancia de extremos reductores y la presencia de AGEs provocan que un COS pueda producir efectos inflamatorios, para lo que requiere ser fagocitado.