Terapia génica dirigida en un nuevo "sitio seguro" en células progenitoras hematopoyéticas humanas para su aplicación en anemia de Fanconi

Resumen

La anemia de Fanconi es una enfermedad hereditaria rara caracterizada por la presencia de mutaciones en cualquiera de los 19 genes que actualmente se conocen y que forman parte de la ruta de Fanconi/BRCA. Está caracterizada por generar inestabilidad genómica, lo que da lugar a anormalidades esqueléticas y predisposición al cáncer, si bien la principal causa de muerte de pacientes pediátricos es el fallo de médula ósea. Uno de los tratamientos alternativos al trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos de pacientes con anemia de Fanconi se basa en la reinfusión de células madre hematopoyéticas autólogas, tras su corrección con vectores lentivirales. Para limitar al máximo los riesgos de este tipo de terapias se están desarrollando nuevas tecnologías de edición génica basadas en la inserción dirigida de los genes terapéuticos. Esta nueva aproximación se fundamenta en la generación de dobles roturas en regiones específicas del genoma, cuya reparación por recombinación homóloga facilitaría la entrada de los genes terapéuticos aportados por ADNs donadores externos con homología por dicha región. En este trabajo se ha desarrollado una aproximación de edición génica en un nuevo ¿sitio seguro¿ del genoma denominado SH6. Para ello se ha trabajado con la línea celular HEK-293H, así como también con progenitores hematopoyéticos humanos purificados en base a la expresión del marcador CD34. Para su desarrollo se han utilizado nucleasas de edición, tales como meganucleasas y TALEN, en combinación con matrices donadoras portadoras del gen marcador EGFP (GM) o del gen terapéutico FANCA (TM). En todos los casos los genes marcadores y terapéuticos estaban regulados por el promotor EF1¿, y flanqueados por dos brazos de homología para el sitio SH6. Estos plásmidos han servido como molde para realizar la terapia génica de edición en el sitio seguro SH6. En primer lugar, se testaron las SH6-meganucleasas y la SH6-TALEN en la línea celular HEK-293H con el donador GM. Se observó que con la meganucleasa SH6v5 y la TALEN SH6 las eficiencias de integración específica en el sitio SH6 eran similares, que la expresión del transgén EGFP era estable y que no había integraciones inespecíficas. Cuando se estudió la eficiencia de estas nucleasas con el donador terapéutico TM, se observó que la integración específica se obtenía con la meganucleasa pero con una menor eficiencia que con la matriz portadora del gen EGFP. Posteriormente trabajamos en la célula diana para el tratamiento de esta enfermedad, progenitores hematopoyéticos CD34+. Se pusieron a punto todas las técnicas a llevar a cabo para asegurar la viabilidad de este tipo celular. Posteriormente se comparó la eficiencia de la meganucleasa SH6v5 y la TALEN SH6 para inducir edición génica utilizando el ADN donador GM y el nucleofector AMAXA I. Utilizando dosis más elevadas de la TALEN SH6 como ADN se obtuvo un 2,1 por ciento de colonias editadas derivadas de progenitores hematopoyéticos, aunque se observó cierta citotoxicidad. Para mejorar la viabilidad de las células, se utilizó el nucleofector 4D y la TALEN SH6 como ARNm, pero no se obtuvieron colonias editadas. Finalmente, la nucleofección en el equipo AMAXA I de las células CD34+ con 10 microg de ADN total de la TALEN SH6 y 4 microg de la matriz GM permitió obtener un 3,13 por ciento de colonias hematopoyéticas en las que se había insertado el gen marcador en el sitio seguro SH6. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el sitio SH6 constituye un sitio seguro de interés para llevar a cabo terapia génica dirigida en progenitores y células madre hematopoyéticas humanas. Estas observaciones tienen un impacto particular para la terapia génica dirigida de enfermedades tales como la anemia de Fanconi, en donde la ventaja proliferativa de un número reducido de células madre corregidas podría tener un impacto clínico significativo.