Identificación de nuevas dianas terapéuticas potenciales e inhibidores del sistema ubiquitina proteasoma para el tratamiento de la malaria

Resumen

La malaria es una de las enfermedades infecciosas que producen un mayor número de muertes en el mundo. Las formas más severas son producidas por la infección del parásito Plasmodium falciparum, el cuál posee un ciclo de vida complejo, ya que adopta diferentes formas a lo largo de su ciclo vital, siendo la etapa intraeritrocítica la más estudiada. La aparición de resistencias frente a todos los antimaláricos conocidos ha llevado a la necesidad de desarrollar nuevos fármacos con nuevos modos de acción, y a la identificación y validación de nuevas dianas terapéuticas. El Sistema Ubiquitina Proteasoma, UPS, es una de las pocas dianas terapéuticas validadas en P. falciparum. Los inhibidores de proteasoma humano inhiben el crecimiento del parásito, incluso en cepas resistentes a los antimaláricos conocidos y en varias etapas de su ciclo de vida. Por ello se hace necesario encontrar compuestos que inhiban específicamente alguno de los componentes del UPS de P. falciparum, con el fin de evitar cualquier tipo de toxicidad. A pesar de ello, el conocimiento del UPS de P. falciparum es limitado, dificultando el desarrollo de nuevos fármacos. El UPS es una modificación postraduccional que controla numerosos procesos celulares esenciales como el ciclo celular y apoptosis, y ha sido asociado con interacciones entre patógeno y hospedador. En este trabajo, se ha identificado el ubiquitoma de P. falciparum y el eritrocito infectado a lo largo del ciclo intraeritrocítico, con el fin de comprender la implicación del UPS en la infección, así como los mecanismos regulados por el UPS en el parásito. Esto requirió el establecimiento de dos metodologías. En primer lugar se estableció un método para obtener cultivos sincrónicos de P. falciparum a alta parasitemia, con el fin de enriquecer eritrocitos infectados en las distintas etapas intraeritrocíticas, reduciendo el ruido proveniente de los eritrocitos no infectados en la identificación por espectrometría de masas. Por otro lado se estableció un método de enriquecimiento basado en la tecnología TUBEs para purificar las proteínas ubiquitinadas. Las proteínas identificadas aplicando ambas metodologías fueron sometidas a varios análisis bioinformáticos para comprender los procesos regulados por el UPS. Se observó una intercomunicación entre parásito y hospedador, ya que mientras que las proteínas ubiquitinadas del parásito incrementaban a lo largo del ciclo, las proteínas del hospedador incrementaban tras la infección pero luego disminuían con el ciclo. Además, tras la infección se produjeron cambios significativos en las vías de señalización del eritrocito plegado de proteínas, endocitosis mediada por clatrina y respuesta a estrés oxidativo mediado por NRF2. Las chaperonas eritrocíticas y los componentes del sistema TriC se vieron afectados. En P. falciparum, fueron las vías replicación del ADN, respuesta a estrés oxidativo mediado por NRF2 y transporte de proteínas y sistema Maurers cleft, las que mostraron los cambios más significativos. Otra estrategia llevada a cabo para la identificación de nuevos fármacos o dianas terapéuticas, fue la de desarrollar dos ensayos celulares de alto rendimiento, un ensayo de AlphaLISA y un ensayo de DELFIA, basados en la trampa TUBEs. Dichos ensayos permiten cuantificar el total de proteínas ubiquitinadas presentes en lisados celulares de eritrocitos infectados con P. falciparum, detectando cambios en sus niveles en presencia de inhibidores. Esto podría permitir identificar nuevos inhibidores de cualquier componente del UPS, sin necesidad de una validación previa o de la expresión de proteínas recombinantes. La idoneidad de ambos ensayos para llevar a cabo campañas de HTS fue confirmada utilizando distintos inhibidores del proteasoma. En conjunto este trabajo valida la importancia del UPS dentro de la biología de P. falciparum, identificando algunas proteínas que podrían convertirse en futuras nuevas dianas antimaláricas.