Diseño, optimización y validación de sistemas de amplificación genómica para el diagnóstico de malaria y filariosis humanas

Resumen

Los plasmodios son esporozoos o apicomplexos que parasitan las células sanguíneas y necesitan dos organismos anfitriones: mosquitos hembra Anopheles para la reproducción sexual, y ser humano y animales para la reproducción asexual. Las especies que infectan al ser humano son: Plasmodium. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale y P. malariae. El parásito de malaria tiene un ciclo de vida complejo, vive principalmente en las células del hígado y los glóbulos rojos de su hospedador humano, pero cuando está en el mosquito vector se encuentra en las glándulas salivares y en el intestino. Sufre varias transformaciones a lo largo de su vida. Los estadios de su ciclo biológico se denominan en base a su morfología: merozoíto, trofozoíto y gametocito en humanos, y zigoto, ookineto y esporozoíto en mosquitos. P. vivax y P.ovale producen hipnozoitos, formas durmientes. Las filarias son nematodos finos y largos, parásitos de la sangre, la linfa y los tejidos subcutáneos y conectivos que producen un conjunto de enfermedades en el humano conocidas como filariosis. Su transmisión se produce por insectos hematófagos generalmente dípteros, mosquitos y moscas, que actúan como vectores. Las filarias se clasifican dependiendo de los tejidos que parasitan las formas adultas en linfáticas, dérmicas y peritoneales. Las especies de filarias de interés clínico para los humanos son Wuchereria. bancrofti, Brugia. malayi y B.timori que producen la filariosis linfática; Onchocerca volvulus, Loa. loa y Mansonella streptocerca se engloban dentro de las filarias dérmicas, y que producen la onchocercosis, la loasis y la mansonelosis, respectivamente y por último Mansonella perstans y M. ozzardi que invaden las zonas peritoneales y que también producen la mansonelosis. Todas ellas presentan estadios larvales, conocidos como microfilarias, que circulan en sangre o en tejido subcutáneo que son las formas infectivas para los vectores.La OMS clasifica la malaria dentro del grupo de enfermedades de la pobreza y a la filariosis dentro de las enfermedades olvidadas o desatendidas. Para el control, eliminación y erradicación de estas enfermedades parasitarias es muy importante contar con buenas herramientas de diagnóstico altamente específico y muy sensible para detectar los casos asintomáticos o de baja carga parasitaria, a la vez que económicos, practicables, de baja invasividad y versátiles. El método tradicional de microscopía es insuficiente para los programas de control de la OMS. En esta tesis se desarrollan varios Sistemas de Análisis Múltiple para malaria, PCR en tiempo real, y para filariosis, Nested PCR y PCR en tiempo real. Todas estas técnicas son sistemas de amplificación de ácidos nucleicos, altamente sensibles y específicos. Estos métodos desarrollados en el laboratorio han demostrado cumplir las exigencias requeridas para cualquier método de diagnóstico, superando los métodos de microscopía y pruebas de diagnóstico rápido. Son métodos que permiten la detección simultánea de varias especies malaria y filarias en un mismo proceso, característica que permite economizar en número de reacciones, tiempo de ejecución y personal, requiere poco cantidad de muestra y el tiempo de respuesta se reduce permitiendo así un mejor diagnóstico para el clínico y tratamiento adecuado para el paciente. El desarrollo de estos Sistemas de Análisis Múltiple en esta tesis ha dado lugar a una serie de publicaciones, tres ya publicadas, una bajo revisión, y dos pendientes de ser sometidos. Ha permitido la detección del primer caso de P. knowlesi en humanos en España,y el primer caso de P. cynomolgi mundial en humanos adquirido de forma natural.La nested PCR desarrollada para filariosis nos permitió una mejor caracterización de las microfilarias atípicas de la amazonia brasileña y detectar microfilarias en localizaciones inusuales de Loa loa y Mansonella perstans en piel. Por sus ventajas estos métodos han sido incorporados en el laboratorio para el diagnóstico rutinario.