Desarrollo de nuevas herramientas para la detección e inhibición de la amiloidosis causada por el prionoide RepA-WH1 en Escherichia coli y caracterización de su toxicidad

Résumé

Las amiloidosis son enfermedades degenerativas (Parkinson, Alzheimer y proteinopatías espongiformes transmisibles, entre otras) resultado de la agregación en oligómeros y fibras amiloides proteotóxicos ensamblados a partir de proteínas anormalmente plegadas. La polimerización de amiloides se basa en el cambio conformacional de una proteína desde un estado soluble a otro agregado con estructura ¿-laminar incrementada, que actúa posteriormente como molde para promover dicha transición en moléculas adicionales de la misma proteína nativa. Los estudios realizados con priones de levadura, como Sup35p/[PSI+], han sido claves para determinar las bases moleculares de las amiloidosis. Sin embargo, los priones de levaduras son determinantes epigenéticos que confieren distintos fenotipos ventajosos, pero rara vez son causantes de proteinopatías. Los estudios realizados durante los últimos años por nuestro grupo sobre la proteína RepA-WH1 han permitido caracterizarla como el primer prionoide (amiloide transmisible de célula madre a hijas pero, al contrario que los priones, no infeccioso) causante de una proteinopatía sintética en bacterias. A lo largo de esta Tesis Doctoral se ha desarrollado un sistema basado en fusiones a distintos reporteros fluorescentes que permite valorar la capacidad de nucleación cruzada entre distintas variantes del prionoide, demostrando así su capacidad de moldear la conformación amiloide in vivo. Asimismo, se han caracterizado mediante técnicas genómicas, proteómicas y estudios fisiológicos las vías de toxicidad de RepA-WH1, concluyéndose que el daño celular es dependiente de la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS), vía reacción de Fenton, apuntando a la implicación del hierro libre intracelular en la citotoxicidad causada por RepA-WH1. Hemos obtenido,además, evidencias de un daño inicial en la membrana inducido por oligómeros amiloides, tal y como se ha descrito para otras proteinopatías humanas. Se ha desarrollado y caracterizado un sistema colorimétrico para la selección y valoración in vivo de amiloides e inhibidores de amiloidosis en E. coli realizando ensayos de lectura corrida de codones ¿stop¿ tempranos. Para ello se utilizaron fusiones del péptido amiloidogénico de RepA- WH1 con el terminador de la traducción RF1 y el gen reportero lacZ. Así, aquellas células en las que la agregación de RF1, inducida por la presencia del péptido amiloide, produce la lectura corrida de un codón ¿stop¿ prematuro en el reportero lacZ, presentan coloración azul en presencia de X-Gal. Por el contrario, si la fusión del péptido amiloide a RF1 no afecta a la solubilidad de este último, las células presentarán coloración blanca. Los resultados obtenidos muestran un aumento en la capacidad de lectura corrida en las quimeras WH1(Rn)-RF1 que portan 2 ó más repeticiones del péptido amiloide. Además, dicho fenotipo es reversible mediante el tratamiento con resveratrol, un polifenol previamente caracterizado como inhibidor de la amiloidosis. Por lo tanto, el sistema de cribado desarrollado en esta Tesis Doctoral, no sólo monitoriza el potencial amiloide de una secuencia peptídica dada sino que, además, es útil para la identificación de compuestos inhibidores del proceso de amiloidogénesis.