Estudio estructural y funcional del sistema de transferencia de azufre CSD (Cysteine Sulfinate Desulfinase) de E.Coli y proteínas con las que interacciona

Resumen

En la presente tesis se ha realizado el estudio estructural y funcional de uno de los tres sistemas de la bacteria modelo Escherichia coli, implicados en la captura de L Cys. En concreto el sistema es CSD (Cysteine Sulfinate Desulfinase), el sistema menos conocido y estudiado de los tres sistemas conocidos en esta bacteria. Este sistema está compuesto de dos proteínas, CsdA y CsdE, las cuales forman un heterotetrámero. La primera de ellas es una enzima homodimérica dependiente de PLP, siendo la encargada de la captura de azufre del aminoácido fuente, L Cys. La segunda de ellas es la aceptora de azufre de CsdA. Estas dos proteínas pueden formar un heterotetrámero. En esta tesis se ha resuelto la estructura de CsdA en distintos estados de oxidación y el complejo formado entre las dos proteínas, pudiendo explicar de esta forma el transporte de azufre a nivel molecular. Además se han hecho distintos ensayos con mutantes de las dos proteína, comprendiendo mejor el modo de interacción entre las dos proteínas a la hora de formar el complejo. Por otro lado, se ha descrito por primera vez la estructura de la proteína TcdA, relacionada directamente con el sistema CSD por otros autores. A través de esta proteína, la cual forma un homodímero, se produce transferencia de azufre desde CsdE. En esta tesis se ha descrito por primera vez la estructura de TcdA, la cual es una ARNt treonilcarbamoiladenosina deshidratasa, actuando sobre la base A37 de los ARNt que reconocen codones de tipo ANN. La modificación realizada sobre la base es una ciclación, proceso que facilita el reconocimiento de los codones, por lo que interviene directamente en la traducción de proteínas. Del mismo modo, se ha desarrollado un modelo de interacción de la proteína con ARNt en un complejo formado por el dímero de TcdA y dos moléculas de ARNt. En anteriores trabajos y por predicción de secuencia, se consideraba TcdA dentro de la familia de las proteínas de tipo E1. La resolución de la estructura ha demostrado que la mitad Nterminal de esta proteína pertenece a esta familia, mientras que la mitad Cterminal es única. En cuanto a los sistemas de transferencia de azufre, también se ha estudiado el crosstalk entre el sistema CSD y el sistema Suf (uno de los tres sistemas de Escherichia coli involucrados en la captura de azufre). Se ha podido demostrar la transferencia desde la proteína CsdA de CSD a la proteína aceptor de azufre del sistema Suf, SufE. En artículos anteriores se ha relacionado el sistema CSD con la proteína PrsA o PRPP sintetasa, proteína que emplea como sustratos ATP y R5P, para producir de forma dependiente de magnesio, PRPP y AMP. Esta proteína está relacionada directamente con la síntesis de purinas y pirimidinas. Por esa razón se ha resuelto la estructura de esta proteína con ATP en su centro activo con el fin de comprender mejor su funcionamiento y poder facilitar el futuro desarrollo de moléculas que puedan modificar estas rutas en organismos patógenos. Otra de las proteína estudiadas es la OPRT (orotato fosforribosil transferasa), la cual toma el PRPP de la reacción anterior más OA, produciendo OMP más PPi. Está proteína ha sido resuelta estructuralmente con las prodrogas 5FOA y 5AOA en su centro activo con el fin de conocer como interacciona la proteína con estos análogos del AO. Además se han realizado ensayos enzimáticos con estos sustratos para caracterizar la proteína. También ha sido estudiada la proteína OPRT del patógeno Mycobacterium tuberculosis, enzima nunca resuelta anteriormente, por lo que aporta información novedosa de esta proteína, pudiendo emplearse en el desarrollo de nuevos fármacos. Estudios cinéticos de la enzima más 5FOA también se llevaron a cabo para calcular las constantes cinéticas de la enzima.