Development of ligands for the validation of the lysophosphatidic acid receptor LPA₁

Resumen

Los receptores acoplados a proteínas G (G protein-coupled receptors, GPCRs) constituyen el 45% de las dianas terapéuticas actuales. Debido a sus características estructurales y propiedades farmacológicas son una familia de proteínas frente a las cuales es posible desarrollar fármacos, resaltando la importancia de la validación de nuevos GPCRs como dianas terapéuticas. La caracterización de la familia de receptores de ácido lisofosfatídico (lysophosphatidic acid, LPA) junto con la importancia de este lisofosfolípido dentro del sistema nervioso central representa el punto de partida para la validación del receptor LPA1, el primer receptor identificado para LPA. En los últimos años se ha puesto de manifiesto el relevante papel que el LPA juega en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Se han descrito los efectos del LPA en el desarrollo, proliferación y diferenciación neuronal así como en el proceso de mielinización; efectos que parecen mediados fundamentalmente por el receptor LPA1, el cual está expresado mayoritariamente en neuronas, oligodendrocitos y células de Schwann. Sin embargo, la elevada similitud entre los subtipos de receptores de LPA (LPA1-6), junto con la variedad de procesos fisiológicos implicados, ha dificultado enormemente el desarrollo de ligandos selectivos, lo que constituye un objetivo prioritario en este momento. Por tanto, en este proyecto de Tesis Doctoral se pretende validar el receptor de ácido lisofosfatídico LPA1 como diana terapéutica. Para ello se ha abordado el diseño de ligandos utilizando como punto de partida la estructura del LPA. Estos han sido evaluados como agonistas del receptor LPA1, estudiándose también su posible carácter antagonista así como su selectividad frente a los demás receptores de LPA. Asimismo, para los agonistas óptimos, se han llevado a cabo diversos ensayos celulares.Para la síntesis de nuevos compuestos se planteó la sustitución del grupo fosfato del LPA por otros fragmentos miméticos de éste, tales como ácidos carboxílicos y borónicos. Por otro lado, se estudió la influencia de la subunidad hidrofóbica, incluyendo cambios en la longitud de la cadena de ácido graso, así como la incorporación de anillos aromáticos. Finalmente, la combinación de los fragmentos presentes en los compuestos que resultaron más activos en el receptor LPA1 sirvió como punto de partida para el comienzo del proceso hit to lead. A lo largo de todo el proceso se identificaron nuevos agonistas con actividad en el receptor de LPA1, con los que se ha conseguido mimetizar tanto la parte ácida como la subunidad hidrofóbica del LPA con nuevas estructuras no descritas hasta este momento. La evaluación del carácter agonista y antagonista de los compuestos sintetizados por el receptor LPA1 se determinó mediante experimentos de movilización de calcio en células RH7777 transfectadas de forma estable con este receptor.Para determinar la selectividad de los compuestos sintetizados se generaron cinco líneas celulares que sobreexpresan de forma estable uno de los cinco subtipos de receptores de LPA (LPA1-5) mediante transfección de células B103 con el plásmido que contiene el receptor de interés LPA1-5 fusionado a la proteína verde fluorescente. Este trabajo se llevó a cabo durante una estancia predoctoral en el laboratorio del Prof. Jerold Chun, en The Scripps Research Institute (La Jolla, California). Hasta este momento, se ha completado el análisis de la actividad de todos los compuestos sintetizados en el receptor LPA2, identificándose siete nuevos agonistas de este receptor.Por último, se llevó a cabo la caracterización en sistemas celulares de los mejores compuestos, que presentaron un comportamiento comparable al del ligando endógeno LPA en los ensayos de internalización, migración y redondeamiento celular.