Receptores de nucleótidos p2x presentes en sistema nervioso central de ratóncaracterización y función

Resumen

El ATP y otros nucleótidos actúan como neurotransmisores en el sistema nervioso mediante su interacción con receptores específicos de membrana conocidos como receptores de nucleótidos o P2. Dentro de éstos se distinguen dos grupos: receptores ionotrópicos P2X (P2X1-7) y metabotrópicos P2Y (P2Y1, 2, 4, 5, 11, 12, 13, 14, 15) (1;2;3, 4). Los receptores P2X spm canales iónicos insertados en la membrana mediante dos hélices transmembrana y son selectivos para cationes de pequeño tamaño (Na+, K+ y Ca2+). Los receptores P2Y presenta 7 segmentos transmembrana y su señalización se encuentra acoplada a proteínas G. Muchos de estos nucleótidos presentan un gran potencial en numerosas patologías, tanto a nivel terapéutico como de marcador de enfermedad (5). Métodos. SE utilizaron como modelos experimentales cultivos de neuronas granulares de cerebelo de ratón así como terminales sinápticas aisladas de cerebro medio de ratón adulto. Para alcanzar nuestros objetivos se utilizaron diferentes técnicas entre las que destacan: RT-PCR siemple y cuantitativa, western blot, ensayos inmunocito- e inmunohistoquímicos, experimentos microfluorimetría acoplada a videoimagen. ESquemas de trabajo 1) Identificación de los receptores P2X presentes en cerebelo y cerebro medio total, así como en neuronas granulares de cerebelo en cultivo y terminales sinápticas aisladas de cerebro medio de ratón mediante ensayos de RT-PCR, western blot e inmunocito- e inmunohistoquímicos. 2) Caracterízación funcional de los receptores P2X en fibras de neuronas granulares a través de experimentos de microfluorimetría acoplada a videimagen. Resultados. Estudios de RT-PCR simple y cuantitativa, junto con ensayos de western-blot e inmunocitoquímicos en cerebelo y cerebro medio de ratón mostraron la presencia de las subunidades P2X1, 2, 3, 4 y P2X7, siendo las más abundantes en subunidades P2X4 y P2X7 en ambas regiones. Posteriormente, estos estudios se realizaron en neuronas granulares de cerebelo y en terminales sinápticas aisladas de cerebro medio. Por un lado, en neuronas granulares se detectó la presencia de las subunidades P2X1, 2, 4, 4, 7, siendo los más abundantes los receptores P2X4, 7. Además se observó una distribución celular diferencial para cada uno de los receptores. De esta forma las subunidades P2X2, 4 aparecían casi exclusivamente a nivel de los somas, mientras que las subunidades P2X1, 3, 7 se detectaron a nivel de soma y fibras axo-dendríticas. Además, las subunidades P2X3, 7 mostraron un patrón de expresión idéntico al de la sinaptofisina (proteína presente en las vesículas sinápticas), lo que indicaba la presencia sináptica de ambas subunidades. Por otro lado, las terminales nerviosas mostraron la expresión de las subunidades P2X2, 3, 8, siendo las subunidad P2X7 la más abundante y la P2X2 la más escasa. Para caracterizar funcionalmente los receptores que se estaban expresando se llevaron a cabo experimentos de microfluorimetría que permitieron determinar la concentración de calcio intracelular resultante tras el tratamiento con agonistas y/o antagonistas, así como de inhibidores selectivos de cada una de las subunidades. Primero se comprobó la funcionalidad de los receptores P2X1, 3 en las fibras de las neuronas granulares en cultivo. Para ello se realizaron tratamientos con el agonista fisiológico, ATP, y el agonista farmacológico Alba, beta-BeATP, específico para las subunidades P2X1 y P2X3, observándose respuestas ambos agonistas. Además, el tratamiento con IP5l 50 nM (inhibidor, en el ranto nanomolar, de las respuestas mediadas por los receptores P2X1), indicó que había respuestas a albabeta-MeATP que se bloqueaban completamente, y otras que no se veían afectadas. Esto demostraba la presencia de receptores funcionales P2X3 que podían estar formando homo o heterómeros entre si. Por otro lado se quiso estudiar la funcionalidad P2X7 tanto en fibras de neuronas granulares como en terminales sinápticas de animales control (silvestres) y KO para esta subunidad. La generación y caracterización del ratón KO utilizado en estos estudios fue realizada por el Dr. Gabel (6). En ensayos de western blot llevados a cabo en macrófagos y en células de las glándulas sublinguales de ratón silvestre y KO, se detectó proteína únicamente en el silvestre. cuando los experimentos se realizaron en extractos de cerebelo y cerebro medio, así como en neuronas granulares en cultivo y terminales nerviosos cerebrales se detectó en dos tipos de ratones. Ensayos de RT-PCR y de secuenciación en cerebelo y cerebro medio utilizando primers diseñados para regiones distintas del cDNA del gen de P2X7 mostraron la expresión de secuencias para el ARNm de esta subunidad en los dos tipos de ratones. Ensayos de microfluorimetría en neuronas granulares y terminales sinápticas mostraron activación del receptor por ATP y BzATP tanto en silvestre como en KO, que diferían en el perfil cinético (7). Además, también se observó un bloqueo de la entrada en calcio en presencia de iones Zn2+ t BBG (inhibidor y antagonista selectivo para la subunidad P2X7, respectivamente) así, como insensibilidad a la suramina (antagonista de todos los receptores P2X excepto del P2X4, 7) en ambos ratones. Mediante técnicas microfluorimétricas utilizando la sonda fluorescente YOPRO-1 se demostró que ni la activación por ATP ni por BzATP de este receptor producía la formación de un microporo en las células, como está descrito en células del sistema inmune. En conjunto, estos resultados apuntan a que en cerebelo de ratón KO debe existir una proteína funcional que comparte cierta tecnología de secuencia con el receptor P2X7 genuino, y que podría estar asumiendo el papel de esta subunidad en los ratones que carecen de ella.