Clonaje y expresión del adnc que codifica a una proteína citosólica de 60 kda implicada en la regulación de la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa endotelial

Résumé

Cambios en la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa endotelial (NOSe) pueden estar implicados en la disfunción endotelial. Hemos demostrado recientemente que el cultivo de células endoteliales aórticas bovinas (BAEC) estimuladas con el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) contienen una proteína citosólica de 60 kDa que forma complejos con la región 3' no codificante del ARNm de la proteína NOSe y que está asociado a su desestabilización. Esta proteína ha sido denominada como proteína inductora de disfunción endotelial (EDIP). El ARN total procedente de BAEC estimulado con TNF-alfa (10 ng/mL) fue usado para clonar el ADNc que codifica a EDIP. El ADNc de EDIP se obtuvo a partir de una librería del bacteriófago Lambda, a la cual se realizó un screening basado en su capacidad de unirse en la región 3'-UTR de NOSe (UTR-L). Además la proteína EDIP se unió a una zona específica rica en citosinas dentro del IUTR-L del ARNm de NOSe, al que previamente habíamos descrito como el sitio de unión de EDIP al ARNm de NOSe, al que previamente habíamos descrito como el sito de unión de EDIP al ARNm de NOSe. La secuencia de nucleótidos del ADNc de EDIP fue de 1,41 Kb, con un marco abierto de lectura de 1179 nucleótidos. Las regiones no codificantes del ADNc de EDIP son 92 nt en 5' y 140 nt en 3'. Las transfección del ADNc de EDIP en BAEC sobreexpresó la proteína EDIP, lo cual, fue asociado con una disminución de la expresión de la proteína NOSe disminuyendo la estabilidad de su ARNm y aumentando la capacidad de adherir neutrófilos. La disponibilidad del ADNc de EDIP y su transfección al endotelio harán posible estudiar en profundidad la importancia de la protección de la expresión de la enzima NOSe para evitar la disfunción endotelial asociada con las enfermedades cardiovasculares.