Análisis funcional de la proteína sigd de salmonella e identificación de nuevos factores de virulencia en un sistema modelo de levadura

Resumen

En los últimos años, el estudio de la virulencia de un buen número de bacterias patógenas ha puesto de manifiesto una estrategia de infección común basada en el aprovechamiento de las rutas de transducción de señales de la propia célula hospedadora. En el caso concreto de Salmonella, cuando las células bacterianas entran en contacto con las células del epitelio intestinal dirigen la translocación de una serie de proteínas a la célula hospedadora mediante un sistema de secreción especializado, el sistema SIP-1 (SST-III). Esto provoca, en primer lugar, la reorganización localizada de actina que promueve la formación de filopodios (ruffing) y la internalización de la bacteria en la vacuola fagocitaria., mediante la acción de proteínas de unión a actina (SipA) y proteínas reguladoras de Cdc42 y Rac1: SopE que es una GEF (moduladora positiva) y SigD, que es una inositol fosfatasa. En este trabajo nos hemos centrado en la caracterización funcional de este último. La sobreexpresión de SigD fusionada a GFP fue tóxica para las células de mamíferos, alterando el citoesqueleto de actina pero sin causar apoptosis, ni alteración del ciclo celular. El estudio de varias versiones mutagenizadas de este efecto bacteriano, permitió el hallazgo de un dominio de baja complejidad existente entre los residuos del 118 al 142 de la región aminoterminal no catalítica de SigD, responsables de este efecto de toxicidad y alteración de las fibras de actina. Es la primera evidencia descrita del carácter bifuncional de SigD. Un estudio detallado trabajando con varios de estos alelos de SigD arrojó que la formación de ruffles y la vacuolización inducida por SigD en células HeLa es dependiente de su actividad fosfatasa, así como que la expresión de este efector provoca la asociación de la GTPasa Rac1 a la membrana plasmática de células HeLe y por tanto su activación. Se ha observado además, a partir de estudios de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos que SigD colocaliza con estructuras del tráfico endocítico, principalmente con endosomas tardíos, siendo para ello importante la presencia del dominio baja complejidad de la región amino-terminal. Al trabajar con mutantes de Salmonella en esta proteína de virulencia se observó que la expresión de SigD provoca la fosforilación de las MAPKs ERK1/2 y está implicada en la secreción de interleuquina 8 durante la infección por Salmonella de células epiteliales en cultivo. Otro de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar la influencia de SigD en el metabolismo de fosfoinosítidos en la célula hospedadora. A partir de estudios de infección con cepas de Salmonella silvestre y deficientes en SigD pudimos observar que la desaparición de PI(4,5)P2 y la acumulación de PI(3,4,5)P3 y PI(3,4)P2 en los ruffles inducidos en células HeLa por el contacto con Salmonella es dependiente de SigD e insensible a inhibidores farmacológicos de fosfatidil inositol 3-quinasas (PI3K), lo que indica que PI(4,5)P2 es un sustrato de SigD in vivo. Además, la formación de PI(3)P en las SCV es también dependiente de SigD y a su vez sensible a inhibidores farmacológicos de las PI3K. Hasta ahora se había establecido que la formación de este último fosfoinosítido era el resultado de la desfosfatización de PI(3,4,5)P3 por SigD. No obstante, en nuestras condiciones, la eliminación de PI(3,4,5)P3 mediante la expresión de la fosfatasa PTEN en células infectadas con Salmonella no impide la formación de PI(3) en las SCV, lo que constituye una evidencia de que la desfosforilación de PI(3,4,5)P3 no es la vía utilizada por SigD para la generación de PI(3)P. Un descubrimiento interesante fue observar que el reclutamiento de la GTPasa humana Rab5 en las SCV (Salmonella-Containing Vacuoles) es también dependiente de esta fosfatasa bacteriana (SigD). La experiencia en nuestro grupo de investigación trabajando con el modelo celular de la levadura nos permitió además descubrir potenciales factores de virulencia bacterianos se Salmonella a partir de la sobreexpresión de una genoteca de S. Typhimurium. Entre ellos, el efector de función desconocida SteC, y el factor de virulencia conocido de Salmonella, SseF de S. Typhimurium, que inhiben el crecimiento de las células de levadura.