Purificación y caracterización bioquímica de las fracciones maoritarias de antígenos de histocompatibilidad de clase I solubles en humanos

Resumen

La presencia de moléculas de clase I solubles (sHLA-I) en suero humano se describió por primera vez en 1968. A pesar de que la naturaleza de estas moléculas solubles aún no se conoce totalmente, se ha asociado la presencia de niveles alterados de las mismas con la progresión de distintos tipos de tumores, algunas enfermedades autoinmunes, embarazo, supervivencia de transplantes y distintas enfermedades infecciosas. Recientemente se ha demostrado que tienen un papel inmunorregulador y son capaces de inducir apoptosis en linfocitos T CD8+ activados, en células NK CD8+ y en linfocitos T gamma-delta. Los sHLA-I presentan dos formas mayoritarias con pesos moleculares de 200-800 KD y 50-60 KD respectivamente. En este trabajo, hemos puesto a punto un método para separar y purificar estas moléculas; hemos realizado caracterización bioquímica, su secuenciación parcial, su caracterización serológica y finalmente hemos investigado los mecanismos por los que se produce su secreción. Para la purificación se utilizó plasma congelado de donantes que tras seis días de almacenamiento había caducado para ser usado en transfusiones. Se determinó el cóctel óptimo de inhibidores de proteasas a usar y se realizó un filtrado previo del plasma. A continuación, se purificaron los antígenos de clase I totales mediante cromatografía de afinidad sobre sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno a la que se había unido covalentemente W6/32 un anticuerpo que reconoce específicamente a dichas moléculas. Por último, se separaron las dos formas mediante filtración sobre Sephacryl S-200. Las moléculas purificantes se caracterizaron mediante SDS-PAGE e isoelectroenfoque. Los datos obtenidos demostraron que la fracción de alto peso molecular estaba constituída por HLA clásico unido a fragmetos de membrana. La fracción de bajo peso molecular presentaba una cadena pesada de unos 39 KD que presentaba un limitado polimorfismo cuando se comparaba con el conjunto de HLA-I clásicos. Para continuar su caracterización se secuenciaron varios péptidos de dicha cadena pesada y tras analizar las secuencias en la base de datos IMGT/HLA obtuvimos que había una alta probabilidad de que estos antígenos estuvieran constituídos por HLA-C. Estos resultados se corroboraron mediante el estudio de la secreción por C1R, una línea celular deficitaria en antígenos de Clase I clásicos, que expresa principalmente HLA-Cw4 en membrana. Se observó que la secreción de sHLA-I se conservaba en dicha línea. Finalmente, se demostró que estas moléculas eran reconocfidas por L-31, un anticuerpo monoclonal específico de HLA-C. Una vez comprobada la naturaleza de estos antígenos se demostró que se pruducían mediante procesamiento alternativo del ARN mensajero en el que se elimina el exón 5 que codifica el fragmento transmembrana de estas moléculas.