Recombinación genética en vih-1secuencias completas de nuevas formas circulantes y únicas en Cuba y Galicia

Resumen

El SIDA está causado por dos retrovirus pertenecientes a la subfamilia de los lentivirus, el VIH-1 y el VIH-2, de los cuales el VIH-1 presenta distribución mundial. El virión del VIH-1 contiene dos copias de ARN genómico asociadas a proteínas virales y rodeadas de una cápside y de una envuelta lipídica en la que se insertan glicoproteínas virales y de la célula huésped. La elevada variabilidad que presenta el VIH-1 se debe a la conjunción de diversos factores donde se puede resaltar la alta frecuencia de recombinación, que constituye una parte intrínseca del ciclo replicativo de los retrovirus debido a que cada virión contiene dos genomas virales que pueden servir alternativamente de molde para la TI durante la síntesis del ADN proviral. Su importancia en la pandemia de VIH-1 se aprecia cada vez más con la creciente detección de formas recombinantes en múltiples áreas geográficas. Se han definido nueve subtipos dentro del grupo M del VIH-1, cada uno de ellos tiene una distribución geográfica característica, aunque todos, excepto el B, se encuentran representados en África central. En áreas donde circulan diferentes subtipos del VIH-1 se pueden originar formas recombinantes intersubtlpo en Individuos Infectados por dos o más virus de distinto subtipo, que se convierten en circulantes cuando se aislan en tres individuos diferentes sin relación epidemiológica (CRFs). La epidemia del VIH-1 en Cuba se caracteriza por presentar una gran diversidad de variantes entre las que hay que destacar un gran número de recombinantes únicos, además de cubanos B y G. En Galicia, existe una prevalencia del 8% de virus que no se corresponden con subtipo B. Teniendo en cuenta las implicaciones de la diversidad genética del VIH-1 en general, y de la recombinación en particular, los objetivos que se plantean en esta Tesis Doctoral son los siguientes: 1. Caracterización filogenética del genoma completo de aislados de VIH-1 recombinantes complejos únicos Identificados en Galicia.. 2. Análisis del origen de estos virus recombinantes de Galicia a través de la búsqueda de otros virus relacionados secuenciados previamente. 3. Caracterización de las estructuras en mosaico de los genomas completos de los recombinantes cubanos UpolIHem y D^/A8"", determinando si constituyen nuevas CRFs, como lo sugieren los análisis de secuencias parciales. 4. Identificación de virus no cubanos relacionados con las formas recombinantes Up0VHenv y Dpd/AB"V de Cuba con el fin de determinar el origen de estos virus recombinantes y su posible circulación en otras áreas geográficas. Se han analizado 10 muestras: 6 de Cuba y 4 de Galicia. Estas muestras fueron previamente caracterizadas en pol y V3. Dos de las muestras de Cuba eran recombinantes U^/H6"" y cuatro eran Dpol/A'"', las muestras gallegas fueron caracterizadas como: GH^/K6- AI^/AI6-AU^/G^and H^I/AI6-.La metodología empleada se resume a continuación: extracción del ARN plasmático o del ADN de células mononucleares de sangre periférica, amplificación mediante PCR del genoma casi completo en 4 fragmentos solapantes y secuenciación. Análisis filogenético por el método de bootscanning y árboles filogenéticos mediante MEGA. Los dos virus Upol/Henv presentan en todo su genoma la misma estructura recombinante entre los subtipos AFGHKU, estos virus agrupan entre ellos en todo el genoma, estos virus agrupan entre ellos y con el genoma de otro virus de Camerún caracterizado previamente (CM53379), además también agrupan en segmentos parciales de secuencias de virus de África Central. Tres de los cuatro virus Dpol/Aenv presentan la misma estructura recombinante ADG. El cuarto virus presenta un genoma recombinante entre los subtipos A/D/G/H. Los cuatro genomas de Galicia se corresponden con genomas recombinantes únicos: AGHKU, A/CRF02_AG/CRF09_cpx, AGU, y AGH. Se han identificado en Cuba dos nuevas CRFs de probable origen africano, la CRF18_cpx y la CRF19_cpx. La CRF18_cpx presenta homología con un virus de Camerún caracterizado previamente (CM53379), probablemente se encuentra circulando en África Central. La identificación de un recombinante único entre las dos nuevas CRFs nos permite preveer que estas CRFs se están transmitiendo entre la población. Ninguno de los recombinantes de Galicia presenta total homología con virus depositados en la base de datos, pero sí en alguna parte de su genoma: X183(AGHKU) con VI354(AGHK) de Gabón, X501 (A/CRF02/CRF09) con G829(02AU) de Gana, X555(AGU) con CRF04_cpx y X575(AGH) con CM53392(AG) de Camerún. En conclusión, en el trabajo desarrollado en esta tesis se han caracterizado mediante análisis de secuencias del genoma completo siete nuevas formas recombinantes complejas del VIH-1 en Cuba y Galicia, dos de ellas circulantes (CRF18_cpx, circulante en Cuba y África central, y CRF19_cpx, circulante en Cuba). Los análisis filogenéticos de sus relaciones con virus caracterizados previamente permiten establecer un origen africano de seis de ellas, mientras que el séptimo (CU64) es un recombinante entre la CRF18 y la CRF19 originado en Cuba. La identificación de las dos nuevas CRFs contribuye a un conocimiento más completo de la epidemiología molecular del VIH-1 en Cuba y África central, estableciendo el origen centroafrlcano de dichas CRFs y permitiendo la caracterización de recombinates secundarios en Cuba entre ambas CRFs y entre las mismas y los subtipos B y G, que también circulan en Cuba. Serán necesarios futuros estudios para la caracterización completa de la gran complejidad de variantes presentes en Cuba, que no tiene precedentes fuera de África central, Incluyendo recombinantes generados a partir de las cepas introducidas ¡nlcialmente, algunos de los cuales, según estudios preliminares, pueden haberse convertido a su vez en circulantes. La caracterización genética de variantes circulantes del 1 ' I » » , I ¿ para el desarrollo de vacunas, respuesta a terapia antirretroviral y desarrollo de mutaciones de resistencia a las mismas, y validez de tests utilizados en la práctica clínica. La alta diversidad genética del VIH-1 detectada en Cuba no tiene precedentes fuera de África Central, y hace de dicho pals un lugar muy apropiado para el estudio de estas implicaciones de la diversidad genética del VIH-1. Los resultados presentados en esta tesis resaltan la importancia del análisis del genoma completo para una caracterización adecuada de las formas genéticas de VIH-1. Por ejemplo, X501 fue identificado como de subtipo A en secuencias parciales de pol y env, pero en análisis del genoma completo pudo caracterizarse como recombinante complejo. Este estudio se añade a las evidencias crecientes de que la recombinación es un fenómeno pervasivo en la generación de diversidad en la pandemia de VIH-1.