Iniciación de la replicación del plásmido promiscuo pmv158interacciones macromoleculares en el orden de replicación

Resumen

La realización de esta Tesis Doctoral se planteó con el objetivo general de esclarecer el mecanismo de la iniciación de la replicación por círculo rodante del plásmido pMV158, mediada por la proteína RepB que codifica el propio plásmido. Gracias al trabajo desarrollado previamente en el laboratorio sobre este tema, sabíamos que RepB se une en el dso a una secuencia formada por tres repeticiones directas que constituyen el locus bind. Basándonos en estos antecedentes decidimos continuar el estudio para completar al análisis de la interacción de RepB con el dso plasmídico. Los resultados obtenidos con técnicas de retardo en gel y de "footprintíng" de alta resolución nos permitieron determinar que RepB se une al locus bind con una afinidad 500 veces superior que al locus nic. La unión de RepB al locus bind en DNA superenrollado facilitaria la unión de otra molécula de proteína en el locus nic, lo que favorecería la extrusión del cruciforme IR-I y la exposición de la secuencia de corte en la configuración monocatenaria apropiada para la actividad nucleolitica de RepB. También se desarrolló un método de purificación de RepB a gran escala, con el fin de obtener cantidad suficiente de proteína para su caracterización estructural y bioquímica. Aunque la proteína purificada es un hexámero en solución, este estado de asociación también se identificó in vivo. La estructura tridimensional del hexámero de proteína se obtuvo por cristalografía de rayos-x. El dominio C-termínal del hexámero presenta simetría rotacional senaria, mientras que el dominio N-terminal, que contiene la actividad endonucleasa, presenta simetría rotacional binaria. El dominio endonucleasa de RepB presenta el mismo plegamiento estructural que el de otras proteínas de las clases Rep y Mob, con un núcleo central constituido por una lámina B formada por cinco cadenas antíparalelas. La información estructural del complejo entre RepB y el DNA del locus bind, obtenida por la reconstrucción tridimensional de imágenes de microscopía electrónica, sugirió que el dominio N-terminal constituye el dominio de unión a DNA. El análisis del estado de asociación de RepB in vivo permitió determinar la coexistencia de formas monomérícas, diméricas y hexamérica de proteïna. Estos resultados podrían indicar que el mecanismo de inicio de la replicación de pMV158 podría ser un proceso dinámico similar al propuesto en otros sistemas de replicación virales, como la replicación de AAV-5. Además RepB podría constituir un nexo evolutivo entre proteínas de replicación de fagos y de plásmidos que replican por cículo rodante, que no presentan dominio de hexamerización, y las de otros virus animales, como papilomavirus o SV40, cuyos dominios C-terminal forman helicasas hexaméricas que no tienen actividad endonucleasa en su dominio N-terminal.