Mecanismo de formación de poros en membranas por la actinoporina sticholisina II

Laburpena

El estudio del mecanismo de formación de poror en membranas por las actinoporinas, como el del resto de toxinas formadoras de poros, es muy interesante para profundizar en el conocimiento de la interacción lípido-proteína. En la presente Tesis Doctoral, se han puesto a punto una serie de metodologías que no sólo han sido útiles para el desarrollo de los experimentos que se recogen en esta Memoria, sino que previsiblemente lo serán para futuros estudios que involucren a esta familia de proteínas. En primer lugar, se ha conseguido la producción recombinante de las secuencias silvestres de las act6inoporinas de Stichodactyla helianthus en E. coli, para lo cual ha sido necesario introducir "mutaciones silenciosas" en el extremo 5' de los correspondientes cDNAs. También se ha desarrollado una metodología que permite la identificación al azar de residuos importantes para la actividad hemolítica de las actinoporinas, que podría ser adaptado a cualquier otra proteína con propiedades hemolíticas. Por último, se ha conseguido estudiar el proceso de unión de la sticholisina II a vesículas lipídicas mediante calorimetría de titulación isotérmica. Los resultados obtenidos muestran que la presencia de dominios de membrana favorece la actividad permeabilizadora de la stucholisina II en células COS-7. También se ha podido proponer, a partir de determinaciones espectroscópicas en el infrarrojo, un modelo del protómero de la sticholisina II formando parte del poro. Todos los anteriores resultados, junto con los obtenidos a partir de variantes mutantes, se discuten en el marco del modelo actual para el mecanismo de formación del poro por las actinoporinas. En este sentido, los resultados apoyan la idea de que la flexibilidad conformacional del extremo N-terminal de las actinoporinas es muy importante para la formación del poro funcional; sin embargo, esta región no sería necesaria para el reconocimiento de la membrana. Por el contrario, la interacción con los lípidos se lograría por la afinidad de una agrupación de aminoácidos aromáticos por la interfase lípido-agua, y por interacciones más específicas, como por ejemplo las que involucran el sitio de unión a fosforicolina. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren la adopción de nuevas estrategias experimentales en el futuro.