Resistencia genética a brucelosis en ganado bovino criollo colombiano blanco Orejinegro y cebu Brahman

Resumen

El objetivo de este trabajo fue identificación de variantes genéticas del gen Slc11a1 y su posible asociación con resistencia natural a brucelosis evaluada mediante desafío infeccioso in vivo e in vitro en bovinos tipo taurino (Bos taurus taurus), se utilizó la raza Blanco Orejinegro y en bovinos tipo cebuino (Bos taurus indicus) con la raza Brahman. La investigación se divide en cuatro etapas. En primer lugar, se caracterizó mediante secuenciación directa un microsatélite (GT)n localizado en la región 3 no traducida del gen Slc11a1 (también llamado Nramp1: proteína del macrófago asociado con resistencia natural), en la raza criolla colombiana Blanco Orejinegro (Bos taurus taurus) (n=140) y Cebú Brahman (Bos taurus indicus) (n=20) y sus cruces cruces (BON x CEBU [n=10]), y CEBU x BON [n=10]). Se evaluó la asociación entre el genotipo en 3'UTR del mencionado gen y la resistencia a la brucelosis evaluado por la sobrevivencia bacteriana luego de un ensayo de desafío infeccioso in Vitro en macrófagos, con una cepa virulenta de Brucella abortus. Se encontró una asociación significativa (p<0.001) entre este fenotipo (sobrevivencia bacteriana) y un alelo del polimorfismo ubicado en 3'UTR del gen SLc11a1. Ninguno de los polimorfismos descritos hasta el momento en el gen Slc11a1 se comportaban como la mutación causal por lo que llevó a cabo un estudio para detectar polimorfismos dentro de la región codificante de este. Se identificaron 11 nuevos polimorfismos del tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism) mediante análisis de SSCP y secuenciación directa del gen el diferentes razas Bos taurus indicus (Cebú brahman), y Bos taurus taurus: Razas Españolas [Rubia Gallega (RG), Asturiana de los Valles (AV) y Pirenaica (PI)], Razas Criollas Colombianas [Blanco Orejinegro (BON) y Romosinuano (ROMO)], y la Raza Holstein Friesian (H) y se compararon sus frecuencias. De estos 11 nuevos polimorfismos cinco se encontraron codificante, uno en la región promotora y cinco en intrones. Tres de estos polimorfismos produjeron un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína en la posición 272 en el exón 9, 321 en el exón 10, y en el amino ácido localizado en la posición 356 en el exón 11, además una delección de tres nucleótidos en la posición 542, en el exón terminal 15. Las frecuencias alélicas y genotípicas presentaron diferencias significativas entre razas (p>0.05). Estas variantes genéticas, fueron posteriormente utilizadas para estudios de asociación. La respuesta inmune a este tipo de agentes infecciosos incluye también la interacción entre varios sistemas genéticos por lo que en la tercera etapa se analizó el efecto de los polimorfismos identificados en la etapa anterior sobre el perfil expresión de genes que codifican para citoquinas (II10, II12p40, Tnf-alfa) y de otros genes relacionados con la respuesta inmune (Onsi, Slc11a1 y Mmp1), en macrófagos bovinos estimulados con una cepa patógena de Brucella abortus mediante un ensayo de desafío infeccioso in vitro. No se encontraron efectos significativos de ninguno de los polimorfismos SNP (p>0.05) sobre la supervivencia bacteriana in vitro, y solamente el resultado obtenido con variante alélica ubicada en el exón 10 (SNP4) podría ser indicativo de una pequeña asociación (p=0,099). Además, cuando se compararon los niveles de expresión de RNA mensajero, todos los genes presentaron un nivel de expresión más elevado a las 24 horas que a las 0 horas pos-infección, aunque estas diferencias sólo fueron significativas en la expresión de los genes Slc11a1, que apareció sobre-expresado cambiando desde 2,51±1,27 a 3,11±1,59 (40% de diferencia), Tnf-alfa cambiando desde 23,91±12,29 a 39,37±19,54 (64% de diferencia) y Mmp1 cambiando desde 106,85±47,66 a 181,38±60,60 (69% de diferencia) (p<0.05). Estos resultados, indicarían que la Brucella abortus dispara una ruta pro-inflamatoria, incrementando los niveles de expresión de Tnf-alfa, pero no de //10 e //12p40, y también que los macrófagos pueden preparar su respuesta inmune, incrementando la expresión de la proteína NRAMP1 para crear un ambiente intrafagosomal que le permita eliminar la bacteria. Por último, se generó una población F1 producto del cruzamiento de animales clasificados como resistentes y susceptibles (R x R, R x S, S x R, S x S), mediante desafío in vitro e in vivo, y para los cuales se determinó el efecto de los polimorfismos tipo SNP localizado el gen Slc11a1 e identificados en la segunda etapa. En este caso, se encontró que el carácter de resistencia ó susceptibilidad a brucelosis evaluado mediante desafío infeccioso in vitro, presentó una componente hereditaria elevada (h²=0,54±0,11). Además, los resultados que se presentan corroboran la asociación existente entre la capacidad de control de la supervivencia bacteriana y el polimorfismo en 3'UTR (p<0,05), así como también con el polimorfismo ubicado en el exón 10 (p<0,05). Por otro lado, se encontró que los individuos clasificados como resistentes presentan una respuesta de anticuerpos antibrucella significativamente diferente (p<0,05) de la presentada por los animales que fueron catalogados como susceptibles, aunque no se encontró asociación significativa entre los SNP's localizados en el gen Slc11a1 y la respuesta de anticuerpos. Una explicación posible a esta ausencia de asociación es que la respuesta en la producción de anticuerpos es causada por una inmunidad humoral, que tiene lugar después de la presentación de antígenos y que permite la generación de anticuerpos.