Análisis proteómico de la superficie celular de levaduras

Resumen

La superficie celular (pared celular y membrana plasmática) de levaduras es una estructura dinámica, implicada en el reconocimiento celular, la relación patógeno-hospedador y responsable de responder a estímulos externos que desencadenan las rutas de transducción de señales. En este trabajo se ha realizado un estudio global de las proteínas que forman parte de dicha superficie mediante diferentes estrategias proteómicas. Utilizando electrofóresis bidimensional y espectrometría de masas se han analizado proteínas de Saccharomyces cerevisiae unidas por puentes disulfuro o débilmente unidas a la superficie celular a partir de las células enteras y de paredes aisladas. También se ha puesto a punto la obtención de las proteínas más expuestas en la superficie celular, el "surfoma", mediante el tratamiento de células vivas con tripsina y la identificación de los péptidos generados mediante nano-HPLC y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Las proteínas identificadas con las tres estrategias, que han demostrado ser complementarias, son, en parte, proteínas cuya localización y función están clásicamente ligadas a la pared celular; sin embargo, también identificamos proteínas implicadas en metabolismo, síntesis protéica, estrés celular, entre otras funciones. Este hecho abre la puerta a futuros estudios orientados a establecer cómo dichas proteínas alcanzan la superficie celular y cuál puede ser su función en dicho compartimento. La membrana de las células no es homogénea. Se han descrito unos microdominios, los "lipid-rafts", en los cuales hay proteínas asociadas que pueden tener importantes funciones biológicas. Se ha estudiado esta fracción en la levadura patógeno oportunista Candida albicans. Utilizando la característica de insoludibilidad en detergentes no iónicos a bajas temperaturas de estos microdominios, se han obtenido los DRMs (Detergent-Resistant Membranes). Mediante técnicas proteómicas basadas en geles de acrilamida monodimensionales hemos identificado en esta fracción proteínas ya identificadas en estos subdominios para otros organismos y otras implicadas en procesos como la biogénesis de la pared celular, la glicosilación de proteínas y el metabolismo de lípidos. Por otro lado, se ha puesto a punto la metodología para el estudio de la expresión diferencial de las proteínas de levaduras e hifas de estas fracciones mediante marcaje isobárico (iTRAQ). La comparación de las proteínas identificadas con las diferentes estrategias ha demostrado que la electroforesis monodimensional de proteínas y la cromatografía de péptidos son más adecuadas que la electroforesis bidimensional para la separación de proteínas de pared celular y membrana debido a sus características físico-químicas. En este trabajo se ha logrado identificar un gran número de proteínas de la superficie celular, consiguiendo una visión global de este subproteona de levaduras.