Abordajes proteómicos para el estudio de la secreción no clásica y la fosforilación en saccharomyces cerevisiae

Résumé

El trabajo realizado en colaboración entre el Departamento de Microbiología II de la Universidad Complutense de Madrid (España) y el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Odense (Dinamarca), ha permitido desarrollar estudios de secreción protéica y fosforilación en Saccharomyces cerevisiae. Un elevado número de proteínas, clásicamente descritas como citosólicas, al carecer de péptido señal para su entrada en la ruta de secreción, han sido localizadas en el exterior de distintos microorganismos, relacionándose con rutas de exportación no convencional. La combinación de aproximaciones de biología molecular, microscopía de fluorescencia y técnicas proteómicas, ha permitido profundizar en la localización subcelular de una de estas proteínas, Eno2p, y su relación con rutas de secreción no clásicas. Se comprobó que los 169 aminoácidos aminoterminales son suficientes para exportar invertasas intracelular al espacio periplásmico. Más aún, estudios de microscopia confocal indicaron que dicho fragmento, fusionado a la proteína verde fluorescente, se localizaba no solo en el citoplasma sino también el membrana plasmática. Además, mediante estudios proteómicos consistentes en fraccionamiento e identificación de proteínas de membranas de S.cerevisiae, se detectó Eno2p, como una proteína asociada a membranas. Por otro lado, se ha puesto a punto una estrategia para la identificación y cuantificación de la fosforilación de proteínas en levaduras tras su estimulación con factor alfa. El marcaje metabólico mediante SILAC, de células con y sin tratamiento, permito la cuantificación relativa de las proteínas y fosfopéptidos. Para el enriquecimiento en fosfopéptidos se han combinado distintos tipos de cromatografías (ATP Sepharoese, IMAC (Quiagen) y dióxido de titanio (TiO2) con DHB), de las cuales la combinación IMAC (Quiagen) junto con TiO2/DHB mostró el mejor rendimiento. Mediante la u