Interacción de la proteína repa con el DNA del plásmido pps10claves sobre la activación conformacional de un iniciador de la replicación

Resumen

RepA es la proteína iniciadora de la replicación del plásmido de Pseudomonas pPS10. En un rango de concentración del orden de micromolar, RepA existe como dímero en disolución. Los dímeros se unen a dos repeticiones invertidas localizadas en el promotor del gen repA, reprimiendo su propia síntesis. Los monómeros, sin embargo, se unen a cuatro secuencias directamente repetidas del origen (denominadas iterones) iniciando replicación. RepA está compuesta de dos dominios ""Winged-Helix (WH). Para unirse a la secuencia del iterón a través de los dos dominios. RepA debe acoplar la monomerización con un cambio conformacional en el dominio N-terminal (WH1), que incluye un motivo cremallera de leucinas. En esta Tesis se muestra por primera vez que la secuencia del iterón, in vitro, disocia los dímeros en monómeros y altera la conformación de RepA, sugiriendo un efecto alostérico. La información estructural reciente sobre el dímero de RepA, junto con la estructura de la forma monomérica de la proteína homóloga RepE del plásmido F, muestran las bases moleculares de la activación de proteínas Rep. En este trabajo se caracterizan mutaciones que sustituyen dos residuos de Leu por Ala en el motivo cremallera de leucinas de RepA. Este mutante, denominado RepA-2L2A, que desetabiliza el núcleo hidrofóbico del WH1, resulta en cambios estructurales que se asemejan a los que ocurren en la activación de la proteína. Proponemos en esta tesis que RepA-2L2A se asemeja a un intermediario de plegamiento en la ruta de obtención de monómeros activos. En este trabajo, se ha observado que interacciones de baja afinidad de la proteína RepA con las secuencias del operador y del iterón, se favorecen utilizando altas concentraciones (hasta 50 mg/ml) de BSA, Ovoalbúmina y Mioglobina. Estos aditivos proteicos, que ocupan una fracción significativa del medio y no participan directamente en la interacción, mejoran la unión inicial de la