Electrostática y estabilidad de la citotoxina alfa-sarcina por resonancia magnética nuclear

Resumen

La alfa-sarcina es el miembro mejor caracterizado desde el punto de vista estructural y dinámico de la familia de las ribotoxinas. Su modo de acción es altamente específico catalizando la hidrólisis de un único enlace fosfodiésteer localizado en una región muy conservada de la subunidad mayor del RN ribosómico. La ruptura de dichos enlace inhibe la maquinaria de biosíntesis en la célula y conduce a la muerte celular. Las bases de la mencionada especificidad y citotoxicidad permanecen aún no bien esclarecidas. El estudio de la estabilidad termodinámica de la citotoxina, la energética y la electrostática de su centro activo abordados en esta memoria, son necesarios para contribuir al mejor entendimiento de estos procesos. Los estudios planteados precisan de una estructura 3D altamente refinada, por lo que se parte de la estructura de alta resolución determinada por RMN refinada con acoplamiento dipolares residuales medidos en los vectores N-H amídicos en un medio orientado magnéticamente. Un análisis de diversos procedimientos para la incorporación de estas nuevas restricciones en el cálculo de estructuras revela las condiciones que pueden ser más favorables para el refinamiento. La caracterización electrostática del centro activo de la citotoxina se aborda a partir de la medida de valores de pKa por resonancia magnética nuclear de 1H en diversos mutantes puntuales (H50Q, E96Q, H137Q, H50/137Q) diseñados para eliminar una o más cargas. Los resultados experimentales se comparan con cálculos teóricos que permiten, a partir de la estructura 3D, interpretar los datos en términos de la conjugación de interacciones individuales que afectan a los residuos, y revelan que las interacciones carga-carga juegan un papel importante en la modulación de los valores de pKa de los residuos catalíticos. Las medidas experimentales de desnaturalización térmica y cálculos teóricos basados en un modelo electrostátic